Os genes tdfJ variantes são expressos a partir de um sítio ectópico induzível no cromossomo gonocócico. As formas de tdfJ de tipo selvagem e mutante foram clonadas em um vetor de complementação projetado para inserir em um sítio ectópico do cromossomo gonocócico entre os loci aspC e lctP. Esta construção contém um promotor induzível por IPTG e um forte sítio de ligação ao ribossoma a montante do gene inserido. (A) Esquema demonstrando o genótipo final de mutantes gonocócicos tdfJ. Plasmídeos contendo tdfJ de tipo selvagem ou mutado foram usados para transformar N. gonorrhoeae cepa FA19 com seu locus tdfJ nativo inativado por um cassete ômega, resultando em gonococos que produzem apenas TdfJ sob indução. (B) Mutantes gonocócicos tdfJ cultivados em placas de ágar GCB com (+) e sem (−) 1 mM IPTG foram ressuspensos em PBS. As suspensões celulares foram padronizadas e usadas para preparar lisados celulares, que foram submetidos a Western blot (WB) para avaliar a produção de TdfJ e o controle de IPTG. Uma verdadeira cepa de tipo selvagem, FA19, e seu mutante isogênico tdfJ foram cultivados sob condições limitadas de zinco para servir como controles positivos e negativos. A coloração de Ponceau (P.S.) dos blots também demonstra uma carga igual. ("FA19 WT" refere-se à verdadeira cepa de tipo selvagem que expressa tdfJ de seu locus nativo; "WT" refere-se ao gene tdfJ de tipo selvagem no sítio ectópico induzível; e "ΔL3H" refere-se a um mutante de deleção em tdfJ, que carece de 15 aminoácidos da α-hélice da alça 3.) O blot é representativo dos resultados de 3 experimentos. Crédito:mBio (2022). DOI:10.1128/mbio.01670-22
Criar uma mutação que iniba como o patógeno bacteriano Neisseria gonorrhoeae causa gonorréia, uma infecção sexualmente transmissível comum, pode oferecer uma nova maneira de prevenir e tratar a doença, de acordo com pesquisadores do Instituto de Ciências Biomédicas da Georgia State University.
Os pesquisadores descobriram que gerar uma mutação em uma parte fundamental do transportador de membrana externa que N. gonorrhoeae usa para sequestrar proteínas de imunidade humana e despojá-las de metais pode ajudar a prevenir a infecção por gonorréia. Os resultados são publicados na revista
mBio .
A gonorreia, que afeta mais de 80 milhões de pessoas em todo o mundo a cada ano, é uma ameaça global à saúde pública devido à crescente incidência de resistência a medicamentos antimicrobianos, aumento dos custos de tratamento e falta de uma vacina protetora. Até 80% dos casos em mulheres são assintomáticos e, se não tratada, a gonorreia pode levar a graves consequências para a saúde, incluindo doença inflamatória pélvica, gravidez ectópica, infertilidade e até endocardite e meningite com risco de vida.
As opções de tratamento eficazes para a gonorreia estão diminuindo devido à evolução da resistência antimicrobiana aos medicamentos existentes. Além disso, é um desafio identificar alvos de vacina adequados porque N. gonorrhoeae altera a expressão das principais moléculas de superfície e amortece a resposta imune. Para impedir que patógenos invasores causem doenças, os humanos contam com um processo chamado imunidade nutricional para limitar a disponibilidade de nutrientes críticos, como ferro e zinco, e matar invasores. As proteínas de ligação a metais sequestram metais e limitam a quantidade de íons metálicos essenciais livres que os patógenos precisam para florescer e causar doenças.
Para superar os esforços de imunidade nutricional do hospedeiro, N. gonorrhoeae implanta transportadores dependentes de TonB (TdTs) em sua membrana externa para se ligar às proteínas de imunidade nutricional do hospedeiro e retirar seus metais. Os TdTs geralmente desempenham papéis fundamentais no estabelecimento de infecções, tornando-os alvos de vacinas promissores.
Um TdT chamado TdfJ reconhece o S100A7 humano, uma proteína de ligação ao zinco que inibe a replicação de patógenos ocultando o zinco. N. gonorrhoeae usa TdfJ para extrair zinco de S100A7 e internalizar o metal. TdfJ contém um dedo alfa-hélice na alça extracelular 3.
Uma alfa-hélice semelhante na alça 3 de outra TdT gonocócica, conhecida como TbpA, desempenha um papel crítico na interação entre TbpA e transferrina humana, necessária para a absorção de ferro. Com base nessas informações, os pesquisadores levantaram a hipótese de que a hélice TdfJ loop 3 (L3H) participa de interações com S100A7 e geraram uma série de mutações no TdfJ L3H para determinar se eles bloquearam a capacidade de N. gonorrhoeae de adquirir zinco e, portanto, de Causar doença.
"A perspectiva de infecções gonocócicas intratáveis estimulou esforços para identificar alvos para novas estratégias terapêuticas e de prevenção, e membros da família de transportadores de metais dependentes de TonB da membrana externa surgiram como candidatos promissores porque desempenham um papel crítico no estabelecimento da infecção", disse o médico. Dra. Cynthia Nau Cornelissen, autora sênior do estudo, Distinguished University Professor e diretora do Centro de Imunologia Translacional do Instituto de Ciências Biomédicas do Estado da Geórgia.
"Nosso estudo revelou que a mutagênese de resíduos-chave dentro do TdfJ L3H reduziu a ligação de S100A7 e a pirataria de zinco pelo gonococo, com os efeitos mais profundos observados com substituições nos resíduos K261 e R262. Em conjunto, esses dados sugerem um papel fundamental para o TdfJ L3H em subverter a imunidade nutricional do hospedeiro."
O estudo caracterizou a interação de ligação entre o importador de zinco TdfJ e sua fonte de zinco humano, S100A7, e também identificou uma região chave de TdfJ que medeia essa interação.
"Detalhamos pela primeira vez a interação de ligação para TdfJ gonocócica e seu ligante humano S100A7. Também identificamos várias mutações na alça 3 de TdfJ que alteram a ligação de S100A7 e a extração de zinco subsequente", disse Stavros A. Maurakis, primeiro autor do estudo e um Ph.D. graduado do Instituto de Ciências Biomédicas do Estado da Geórgia.
"Com uma compreensão mais completa das intrincadas relações entre esses receptores de nutrientes bacterianos e suas fontes de nutrientes do hospedeiro, podemos ajudar a pavimentar o caminho para a identificação de profilaxia e/ou tratamento eficaz para uma importante doença humana".
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