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A clonagem molecular é uma técnica fundamental na biologia moderna que todo estudante e pesquisador deve dominar. Ao utilizar enzimas de restrição, os cientistas cortam o ADN de cadeia dupla em fragmentos manejáveis ​​que podem então ser inseridos num vector plasmídico e expressos num hospedeiro bacteriano.

Como as enzimas de restrição reconhecem o DNA

As enzimas de restrição são endonucleases que se ligam a sequências curtas de DNA específicas, chamadas locais de restrição, e clivam a estrutura do fosfodiéster precisamente nessas posições. Com mais de 90 enzimas distintas catalogadas, cada uma tem como alvo uma sequência única e corta seu local até 5.000 vezes mais rápido do que qualquer sequência não reconhecida.

Extremidades pegajosas versus pontas cegas

Quando uma enzima de restrição corta, os terminais resultantes podem ser extremidades pegajosas ou extremidades cegas . As extremidades adesivas contêm saliências de fita simples que são complementares entre si; essa “aderência” impulsiona o emparelhamento rápido e específico entre dois fragmentos. As pontas rombas, por outro lado, possuem fios perfeitamente emparelhados, sem saliências, tornando-as menos seletivas durante a ligadura.

Como as extremidades adesivas emparelham apenas com suas saliências complementares, o fragmento inserido pode entrar no plasmídeo em uma orientação única e definida. As extremidades cegas não oferecem esse controle direcional, permitindo que o fragmento seja ligado na orientação cabeça-cauda ou cauda-cabeça.

Por que as pontas adesivas são importantes na ligadura

Embora tanto os terminais pegajosos quanto os rombos exijam, em última análise, a DNA ligase para formar uma fita contínua, as extremidades pegajosas reduzem a quantidade de DNA necessária para uma reação bem-sucedida. Suas saliências complementares se encontram de forma mais rápida e eficiente, permitindo que a ligação prossiga com concentrações mais baixas de inserto e vetor.

Em contraste, as extremidades cegas devem depender unicamente da concentração de moléculas de DNA para colidir e alinhar, o que muitas vezes necessita de quantidades de entrada mais elevadas para alcançar eficiências de ligação comparáveis.

Várias enzimas, uma saliência

Uma das características mais poderosas das enzimas com extremidades coesivas é que diferentes enzimas podem gerar saliências idênticas, mesmo que reconheçam sequências distintas. Por exemplo, BamHI , BglII e Sau3A todos produzem a mesma saliência pegajosa 5'-GATC-3'. Esta redundância aumenta a probabilidade de que um par de locais adequados flanqueie um gene de interesse, dando aos investigadores flexibilidade na escolha da estratégia de restrição ideal.

Os plasmídeos projetados também podem colocar locais de restrição adjacentes uns aos outros, aumentando ainda mais a versatilidade dos projetos de clonagem.