Nova abordagem de microscopia de super-resolução visualiza estruturas e agrupamentos celulares internos por meio da ativação seletiva do plano
Imagens de fluorescência de núcleos em um esferóide celular marcado por rsGamillus-S com diâmetro de 100 µm observado com campo amplo, SPA-SIM e 3DSIM a uma profundidade de 43 µm. Crédito:De Nature Methods (2024). DOI:10.1038/s41592-024-02236-3 Para estudar organismos vivos em escalas de comprimento cada vez menores, os cientistas devem desenvolver novas técnicas para superar o chamado limite de difração. Esta é a limitação intrínseca à capacidade de um microscópio de focar objetos menores que o comprimento de onda da luz usada.
A microscopia de iluminação estruturada é uma das técnicas de super-resolução que pode ajudar, iluminando uma luz com padrão sinusoidal em uma amostra para obter uma imagem mais nítida. No entanto, a luz de fundo proveniente de regiões fora de foco ainda pode manchar a imagem final.
Em um estudo publicado recentemente na revista Nature Methods , pesquisadores da Universidade de Osaka demonstraram uma nova abordagem para microscopia de super-resolução capaz de observar estruturas dentro de uma única célula ou de um aglomerado de células. Isto foi conseguido selecionando apenas um plano desejado para a imagem usando uma fina iluminação de "folha de luz", projetada perpendicularmente à lente, para ligar os fluoróforos.
“Mostramos que a ativação do plano seletivo nos permite obter imagens de microestruturas densas dentro das células com excelente nitidez não disponível anteriormente”, diz o autor principal do estudo, Kenta Temma. Ou seja, a luz "estruturada" sinusoidal excitou seletivamente apenas um plano fino onde os fluoróforos no estado estavam localizados, o que permitiu imagens de super-resolução sem fundo.
. Configuração e esquemas de imagem do SPA-SIM (microscopia de iluminação estruturada por ativação de plano seletivo). Distribuição simulada do padrão de excitação efetivo no SPA-SIM. Crédito:K. Temma, R. Oketani e outros
Imagens de projeção 3D de uma célula HeLa viva expressando Skyla-NS nas mitocôndrias observadas com SPA-SIM (método proposto) e 3DSIM convencional. Crédito:De Nature Methods (2024). DOI:10.1038/s41592-024-02236-3
Embora alguns métodos anteriores utilizassem emissão aleatória de fluorescência de moléculas únicas ou uma segunda fonte de luz em forma de "donut" para desativar ou esgotar fontes fluorescentes fora de uma área desejada, este novo método pode ser mais suave para células que podem ser danificadas por exposição intensa ou longa a luz.
Os investigadores acreditam que a sua abordagem é especialmente eficaz quando se tenta compreender o que está a acontecer em sistemas vivos com estrutura espacial, que muitas vezes podem exibir luz de fundo fora do plano focal desejado. Isso inclui organoides, que são montagens artificiais de diferentes tipos de células destinadas a reproduzir muito melhor o comportamento dos órgãos reais do corpo em comparação com coleções de células cultivadas em uma placa de Petri plana.
“Prevemos que nossa técnica será útil para futuros estudos biológicos de aglomerados de células 3D, incluindo organoides”, diz o autor sênior, Katsumasa Fujita. O mesmo poderia aplicar-se a outros sistemas biológicos complexos.
O artigo, "Microscopia de iluminação estruturada de ativação de plano seletivo", foi publicado na Nature Methods .
