Uma nova variação do sistema de edição de genes CRISPR-Cas9 facilita a reengenharia de grandes quantidades de células para aplicações terapêuticas. A abordagem, desenvolvida no Gladstone Institutes e na UC San Francisco (UCSF), permite que os cientistas introduzam sequências de DNA especialmente longas em locais precisos nos genomas das células com eficiências notavelmente altas, sem os sistemas de entrega viral que tradicionalmente são usados ​​para transportar DNA para as células.
"Um dos nossos objetivos por muitos anos tem sido colocar longas instruções de DNA em um local-alvo no genoma de uma forma que não dependa de vetores virais", diz Alex Marson, MD, Ph.D., diretor do Gladstone -UCSF Institute of Genomic Immunology e autor sênior do novo estudo. "Este é um grande passo para a próxima geração de terapias celulares seguras e eficazes".

No novo artigo publicado na revista Nature Biotechnology , Marson e seus colegas não apenas descrevem a tecnologia, mas mostram como ela pode ser usada para gerar células CAR-T com potencial para combater o mieloma múltiplo, um câncer no sangue, bem como para reescrever sequências de genes onde mutações podem levar a doenças imunes hereditárias raras. doenças.

"Mostramos que podemos projetar mais de um bilhão de células em uma única corrida, o que está bem acima do número de células que precisamos para tratar um paciente individual", diz o primeiro autor Brian Shy, MD, Ph.D., pesquisador clínico no laboratório de Marson.

De DNA de fita dupla a fita simples

O CRISPR-Cas9, um sistema que edita genes dentro de células vivas, tem sido usado como ferramenta básica de pesquisa na última década. Cada vez mais, muitos cientistas clínicos estão entusiasmados com o potencial do CRISPR-Cas9 para gerar terapias de células vivas.

Com a edição de genes, pode-se desligar, excluir ou substituir um gene mutante causador de doenças ou aumentar a atividade de combate ao câncer de uma célula imune, entre outras coisas. Embora as primeiras aplicações terapêuticas do CRISPR-Cas9 tenham entrado recentemente em testes clínicos, a tecnologia ainda é limitada pelo desafio de produzir com segurança grandes quantidades de células editadas corretamente.

Tradicionalmente, os pesquisadores confiam em vetores virais – as conchas de vírus sem seus componentes causadores de doenças – para transportar o DNA (chamado de modelo de DNA) usado para terapia genética nas células. No entanto, a fabricação de grandes quantidades de vetores virais de grau clínico tem sido um grande gargalo na obtenção de terapias celulares para os pacientes. Além disso, os pesquisadores não podem controlar facilmente onde os vetores virais tradicionais inserem genes dentro do genoma.

"O uso de vetores virais é caro e consome muitos recursos", diz Shy. "Um grande benefício de uma abordagem não viral à engenharia genética é que não estamos tão limitados pelo custo, complexidade de fabricação e desafios da cadeia de suprimentos".

Em 2015, o grupo de Marson - em colaboração com o laboratório da pioneira do CRISPR Jennifer Doudna, Ph.D. - mostrou pela primeira vez que poderia inserir modelos curtos de DNA em células imunes sem vetores virais, usando um campo elétrico que torna as membranas externas das células mais permeáveis . Em 2018, eles desenvolveram um método para cortar e colar sequências de DNA mais longas em células imunes com CRISPR e publicaram na Nature .

Então, em 2019, os pesquisadores descobriram que, usando também uma versão modificada dos modelos de DNA que podem se ligar à enzima Cas9 – a mesma proteína que atua como tesoura molecular durante a edição do gene CRISPR – eles poderiam entregar as novas sequências ao genoma alvo. local com mais eficiência. Esse trabalho foi publicado em Nature Biotechnology .

No entanto, mais trabalho era necessário para melhorar o rendimento de células imunes projetadas com sucesso e tornar o processo compatível com a fabricação de futuras terapias celulares. Esses objetivos motivaram o estudo atual da equipe.

O DNA pode existir em fitas simples ou duplas (como peças opostas de velcro), e Cas9 se liga ao DNA de fita dupla. Os pesquisadores descobriram rapidamente que altos níveis de molde de DNA de fita dupla podem ser tóxicos para as células, de modo que o método só poderia ser usado com baixas quantidades de molde de DNA, levando a uma baixa eficiência.

A equipe sabia que o DNA de fita simples era menos tóxico para as células, mesmo em concentrações relativamente altas. Assim, no novo artigo, eles descrevem um método para anexar a enzima Cas9 modificada a um molde de DNA de fita simples, adicionando apenas uma pequena saliência de DNA de fita dupla nas extremidades.

"Isso nos dá uma abordagem equilibrada, o melhor dos dois mundos", diz Marson.

O DNA modelo de fita simples poderia mais que dobrar a eficiência da edição de genes em comparação com a abordagem mais antiga de fita dupla. E as extremidades de fita dupla das moléculas permitem que os pesquisadores usem Cas9 para melhorar a entrega de vetores não virais nas células.

"Esta tecnologia tem o potencial de tornar novas terapias celulares e genéticas mais rápidas, melhores e menos caras", diz Jonathan Esensten, MD, Ph.D., autor do novo trabalho que é professor assistente de medicina laboratorial na UCSF e um investigador afiliado em Gladstone.

Um caminho para a clínica

No estudo, os pesquisadores usaram o novo modelo de DNA para gerar mais de um bilhão de células CAR-T que visam mieloma múltiplo. As células CAR-T são células T imunes geneticamente modificadas para combater efetivamente células ou cânceres específicos. Com os novos modelos direcionados por Cas9 de fita simples, aproximadamente metade de todas as células T ganharam o novo gene e, como resultado, foram convertidas em células CAR-T.

"Sabíamos que direcionar os modelos de DNA para um local específico no genoma, chamado local TRAC, melhoraria a potência antitumoral das células CAR-T", diz Justin Eyquem, Ph.D., coautor do estudo. novo artigo, professor assistente de medicina na Divisão de Hematologia e Oncologia da UCSF e investigador afiliado em Gladstone. "Esta nova abordagem não viral nos permite atingir esse direcionamento com muito mais eficiência, o que acelerará o desenvolvimento da próxima geração de terapias com células CAR-T".

Além disso, os pesquisadores mostraram que sua abordagem poderia, pela primeira vez, substituir integralmente dois genes associados a doenças imunológicas genéticas raras, os genes IL2RA e CTLA4.

No passado, os cientistas mostraram que poderiam substituir pequenas seções do gene IL2RA onde determinados pacientes têm mutações. Agora, a equipe de Marson provou que pode substituir todos os genes IL2RA e CTLA4 de uma só vez - uma abordagem "tamanho único" que poderia tratar muitos pacientes com diferentes mutações nesses genes, em vez de gerar modelos personalizados para a mutação de cada paciente. Quase 90 por cento das células tratadas com esta abordagem de engenharia genética ganharam as versões saudáveis ​​dos genes.

Os pesquisadores agora estão buscando aprovação para avançar em ensaios clínicos usando a tecnologia CRISPR não viral na terapia com células CAR-T e no tratamento da deficiência de IL2RA. + Explorar mais

Estudo incentiva abordagem cautelosa da terapêutica CRISPR