Condensados biomoleculares:estudo revela baixo poder preditivo de ensaios estabelecidos de separação de fases líquido-líquido
As proteínas precisam encontrar seus parceiros na célula entre milhões de potenciais parceiros de interação. Crédito:MPI de Fisiologia Molecular As células vibram com milhões de biomoléculas diferentes que se difundem caoticamente através de suas subestruturas, mas conseguem garantir uma especificidade funcional e espacial requintada.
Biomoléculas distintas interagem especificamente em processos celulares e levam a respostas celulares direcionadas. Isto é frequentemente conseguido direcionando biomoléculas para compartimentos subcelulares. Compartimentos como as mitocôndrias são separados espacialmente por membranas. Outros, como os nucléolos, não possuem nenhum limite de membrana.
A forma como esses compartimentos sem membranas se formam ainda é um dos maiores mistérios da biologia. Nos últimos anos, um fenômeno denominado separação de fases líquido-líquido (LLPS) foi proposto como a força motriz da montagem do compartimento.
O grupo de Andrea Musacchio, Diretor do Instituto Max Planck de Fisiologia Molecular, desenvolveu agora uma estratégia de validação para avaliar o papel do LLPS na formação de compartimentos e para avaliar métodos comuns para detectar propriedades de LLPS. O estudo foi publicado na revista Molecular Cell .
A aplicação da estratégia ao processo de montagem do centrômero durante a divisão celular, que foi proposto para ser conduzido por uma estrutura LLPS (o complexo cromossômico passageiro, ou CPC), não conseguiu identificar o LLPS como um fator crucial, confirmando o baixo poder preditivo desses ensaios . Esta nova estratégia tem o potencial de se tornar uma ferramenta importante para validar o papel de outros potenciais impulsionadores de SLPS identificados até agora.
As proteínas, que desempenham a maior parte das funções do nosso corpo interagindo com outras proteínas, enfrentam um dilema:movem-se pela célula com 40 milhões de potenciais parceiros de interação.
Encontrar o parceiro certo pode, portanto, parecer procurar uma agulha num palheiro. No entanto, se a probabilidade de uma proteína encontrar o parceiro certo no momento certo por acaso pode parecer baixa – a célula encontrou uma estratégia para reunir proteínas que se assemelha a encontrar um parceiro potencial no trabalho, num café ou no clube:Espacial dicas guiam as proteínas para compartimentos celulares definidos, como a membrana plasmática ou a mitocôndria.
O processo de divisão celular, por exemplo, é iniciado por processos de sinalização na membrana celular, que ativa enzimas cujos sinais chegam ao núcleo da célula para desencadear a transcrição genética direcionada.
Durante a divisão celular subsequente, uma infinidade de interações proteicas específicas levam à formação de um complexo proteico multicamadas nos centrômeros dos cromossomos, o que garante uma distribuição livre de erros dos cromossomos em uma célula-mãe para suas duas filhas.
A natureza desenvolveu uma certa química para proteínas em interação:proteínas destinadas umas às outras são equipadas com interfaces evolutivamente conservadas e expostas com identidades químicas detalhadas em sua estrutura 3D que são complementares entre si. Esses motivos são encontrados em todas as espécies e permitem interações proteicas altamente específicas.
Uma mudança de paradigma?
Na virada do século passado, foram observados pela primeira vez os primeiros compartimentos celulares não delimitados por limites físicos. Sabemos agora que nucléolos, corpos P ou grânulos de estresse concentram macromoléculas, principalmente proteínas e RNA, e têm funções importantes na célula.
A descoberta destes compartimentos sem membrana abriu um novo campo de investigação cheio de questões sem resposta, a mais desafiante das quais é como estes compartimentos são formados e como mantêm a sua estrutura.
Nos últimos anos, a ideia de que estes compartimentos se formam por um processo denominado desmistura líquido-líquido ou separação de fases líquido-líquido, comparável à formação espontânea de gotículas de óleo na água, ganhou impulso considerável.
De acordo com esta visão, os compartimentos sem membrana são "condensados" cuja formação é baseada em interações transitórias, fracas e inespecíficas de proteínas "condutoras", causando em última análise a sua acumulação ali em concentrações mais elevadas do que no meio circundante.
Ensaios que investigam as propriedades de separação de fases de proteínas fora da célula identificaram dezenas desses drivers até o momento, incluindo o complexo cromossômico passageiro (CPC), que se afirma formar condensados no centrômero para modular sua organização e função durante a mitose.
In vitro não é in vivo:você não pode negligenciar o citosol
“Para muitos cientistas, a separação de fases tornou-se a explicação padrão para a formação de compartimentos sem membrana. No entanto, há poucas evidências de que os ensaios LLPS realizados in vitro possam realmente prever um processo fisiológico no ambiente da célula”, diz Musacchio.
Juntamente com sua equipe, ele desenvolveu uma estratégia para avaliar um ensaio LLPS amplamente utilizado e seu poder preditivo, e aplicou-a ao CPC.
"Em nossa opinião, um grande ponto fraco dos ensaios é que eles não modelam o solvente com precisão suficiente. O solvente define a solubilidade de uma proteína e, portanto, a sua capacidade de interagir com outras proteínas."
A fim de imitar o ambiente natural da célula o mais próximo possível, o cientista adicionou lisados diluídos de células bacterianas ou de mamíferos aos tampões LLPS padrão. Mesmo em concentrações altamente diluídas, os lisados impediram completamente a formação de condensados. Para avaliar o quão geral isto era, os cientistas repetiram a mesma experiência com várias proteínas adicionais, todas mostrando propriedades LLPS no ensaio padrão. E de fato, em todos os casos a adição de lisados celulares dissolveu os “condensados”.
“Estes resultados confirmam a nossa suposição de que o ambiente celular amortece eficazmente as interações fracas inespecíficas que se pensa causarem LLPS in vitro”, diz Musacchio.
Pouco poder preditivo
As interações e funções das proteínas na célula são fortemente reguladas pelas chamadas modificações pós-traducionais. A adição ou remoção direcionada de grupos fosfato em locais críticos, por exemplo, pode interromper a interação entre duas proteínas com efeito imediato. Essas modificações naturais podem ser imitadas em laboratório por mutações e são o método de escolha quando se trata de investigar muitos processos celulares.
Ao introduzir mutações em quatro resíduos envolvidos no reconhecimento de sinais fosforilados, o cientista gerou um mutante do CPC que não pode ser recrutado para os centrômeros e não se acumula ali. No entanto, este mutante ainda apresentou potencial total de LLPS no ensaio in vitro, mostrando que o ensaio é incapaz de prever a localização e função do CPC.
"Nossos resultados mostram que o LLPS de um único componente in vitro não pode prever a solubilidade e a localização no ambiente complexo e lotado da célula. A lista de supostos andaimes LLPS identificados através dos ensaios estabelecidos precisará de um reexame extensivo, e a estratégia de validação que nós que apresentamos aqui podem nortear esse esforço", diz Musacchio.
"No futuro, planejamos repetir nossos experimentos com muitos supostos andaimes LLPS, especialmente aqueles que se tornaram carros-chefe no crescimento do campo LLPS. Nossos experimentos mostram que o citosol é um solvente potente cujo papel não pode ser negligenciado. Portanto, é será importante gerar meios citomiméticos apropriados como padrões para avaliar reações bioquímicas in vitro. Tentaremos contribuir para esta área de pesquisa."
