Ilustração esquemática da microscopia 3DOM. Crédito:PhotoniX (2024). DOI:10.1186/s43074-024-00127-6 Devido à alta transparência das células, é muito difícil observar as organelas dentro delas. Os biólogos podem rotular organelas específicas para observação através de coloração fluorescente. Isso é um tanto análogo a estar em um ambiente sem luz onde todos estão vestidos inteiramente de preto, dificultando encontrar seus amigos. Fazendo com que nossos amigos segurem um bastão fluorescente, podemos localizá-los facilmente.
Uma questão interessante é:se o ângulo do bastão fluorescente segurado pelo meu amigo representa uma espécie de sinal, como podemos detectar tal informação angular?
Assim como neste quebra-cabeça, devido à natureza altamente transparente das células, é muito difícil observar as organelas nelas contidas. Com a coloração fluorescente, os biólogos podem rotular organelas específicas para observação. A maioria das moléculas fluorescentes aparecem como dipolos direcionais durante a absorção ou emissão.
A orientação dos fluoróforos pode revelar informações importantes sobre a estrutura e dinâmica das organelas associadas. A microscopia de polarização de fluorescência também se desenvolveu como uma ferramenta indispensável para estudar as características de orientação de biomoléculas.
Para superar o desafio da microscopia de polarização de fluorescência convencional limitada pela difração óptica, foram propostas técnicas aprimoradas de microscopia de polarização de fluorescência de super-resolução, como microscopia de orientação-localização de molécula única (SMOLM) e modulação de polarização (por exemplo, SDOM, SPoD, etc. ).
No entanto, do ponto de vista biotecnológico, apesar do papel significativo dos filamentos biológicos (por exemplo, filamentos de actina e microtúbulos) nas funções celulares, faltam abordagens com resolução de orientação 3D e alta resolução temporal-espacial para estudá-los in vivo.
Crédito:PhotoniX (2024). DOI:10.1186/s43074-024-00127-6
Para resolver o problema da resolução da orientação dipolo, o grupo de pesquisa do professor Xi Peng da Universidade de Pequim desenvolveu um método de mapeamento de orientação dipolo 2D, SDOM, e mapeamento de orientação dipolo de super-resolução com detecção de lock-in óptico, OLID-SDOM. Em PhotoniX , o grupo de pesquisa relata um microscópio de mapeamento de orientação 3D de super-resolução denominado 3DOM.
O método 3DOM é baseado na microscopia de iluminação estruturada polarizada desenvolvida pelo grupo de pesquisa. Invertendo o princípio da interferência de fenda dupla de Young e combinando-o com o princípio dos caminhos de luz reversíveis, diferentes ângulos das listras são usados para produzir feixes de primeira ordem positivos e negativos em diferentes direções.
Além disso, uma única direção de iluminação inclinada pode ser produzida simplesmente bloqueando a luz negativa de primeira ordem correspondente. Ao projetar essa inclinação em diferentes ângulos do eixo z e reconstruir a imagem usando o algoritmo FISTA, a resolução de alta precisão da orientação dipolo pode ser alcançada combinando os coeficientes de modulação de polarização e os resultados da reconstrução no espaço recíproco.
No geral, o método 3DOM proposto supera efetivamente as limitações da microscopia de polarização de fluorescência na resolução espacial e no mapeamento de orientação 3D usando imagens de campo amplo.
3DOM fornece uma compreensão mais abrangente da estrutura espacial 3D das moléculas de fluoróforo. Isso nos permite não apenas distinguir várias organizações do citoesqueleto (filamentos de actina e microtúbulos), mas também obter informações valiosas sobre a compactação da ligação dos filamentos e a ordem das estruturas subcelulares.
Além disso, o 3DOM possui um potencial significativo na flexão do DNA e na orientação de organelas membranosas. Uma das principais vantagens do 3DOM é a facilidade de atualização para sistemas de campo amplo existentes. A implementação simples, informações precisas de orientação dipolo 3D e resolução espaço-temporal superior do 3DOM tornam-no adequado para uma ampla gama de aplicações, melhorando sua acessibilidade e usabilidade em diferentes ambientes de pesquisa.
Esta ferramenta poderosa capacita os pesquisadores a desvendar as complexidades intrincadas da estrutura subcelular, biomecânica e biodinâmica, revolucionando nossa compreensão dos processos celulares. Os pesquisadores prevêem que o 3DOM avance na compreensão de uma infinidade de estruturas biológicas e interações que operam em nanoescala.
