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Determinar a concentração de células em uma amostra líquida é uma tarefa rotineira, porém essencial em laboratórios clínicos e de pesquisa. Contagens precisas de células informam os médicos sobre o estado imunológico de um paciente, ajudam a diagnosticar infecções e orientam avaliações de fertilidade. Na pesquisa, permitem aos cientistas quantificar bactérias, leveduras e outros microrganismos para estudos ecológicos ou processos industriais. O método mais comum e confiável para contagem de células é o hemocitômetro, uma câmara de contagem precisa amplamente ensinada em cursos de biologia e usada em laboratórios profissionais em todo o mundo.

1. Diluir a amostra

Quando uma suspensão celular contém milhões de células, a contagem direta torna-se impraticável porque as células se sobrepõem e não podem ser distinguidas. Para obter uma diluição adequada, transfira 10 µL da solução original para um tubo de ensaio estéril que contenha 90 µL de um diluente apropriado (por exemplo, solução salina tamponada com fosfato ou meio de cultura). Misture bem; isso cria uma diluição dez vezes maior (fator de diluição=10⁻¹). Rotule o tubo e repita o procedimento até que a amostra esteja diluída o suficiente para uma contagem precisa. Cada diluição adicional de dez vezes multiplica o fator de diluição por 10 (por exemplo, uma segunda diluição dá 10⁻², uma terceira 10⁻³).

2. Conte as células

O hemocitômetro é uma câmara pequena e transparente com uma grade gravada na superfície inferior. Sua profundidade é normalmente de 0,1 mm, e a grade é dividida em quadrados grandes e pequenos cujas áreas são 1 mm² e 0,04 mm², respectivamente. Pipete um pequeno volume da suspensão diluída no poço da câmara. A ação capilar espalha o líquido pela grade. Coloque a câmara em uma platina de microscópio e visualize-a em baixa ampliação (×10–×40).

Escolha um padrão conveniente de quadrados – geralmente os quatro cantos e um quadrado central – para contar pelo menos 100 células. Para células grandes, utilize os quadrados maiores; para células menores, conte os quadrados menores. Registre o número de células em cada quadrado selecionado.

3. Calcule a concentração da amostra diluída

Cada quadrado grande tem um volume de 0,1mm³ (0,1mm×1mm²). Se você contou 103 células em cinco quadrados grandes, o volume total contado será de 0,5 mm³. Dobrar esse volume para representar 1 mm³ completo dá 206 células. Como 1mL equivale a 1cm³ e contém 1.000mm³, a concentração na amostra diluída é:

• Células por mm³ =206 células ÷ 1mm³ =206 células/mm³
• Células por mL =206 células/mm³×1.000 =206.000 células/mL

Fórmula:Volume da área contada×número de quadrados =volume total contado
Células ÷ volume total contado =células por mm³
células por mm³×1.000 =células por mL

4. Determine a concentração da amostra não diluída

Ajuste para o fator de diluição utilizado durante a preparação. Para um fator de diluição de 10⁻² (ou seja, 1:100), a concentração original da amostra é:

• Células por mL (diluídas) ÷ fator de diluição =206.000 ÷ 0,01 =20.600.000 células/mL

Assim, a suspensão inicial não diluída continha aproximadamente 20,6 milhões de células por mililitro.