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Antes que o DNA possa ser sequenciado ou editado, os pesquisadores devem primeiro isolá-lo da matriz celular. Embora as células contenham uma mistura de proteínas, lípidos, hidratos de carbono e pequenas moléculas, as propriedades químicas únicas do ADN permitem que este seja separado e purificado para análise posterior.
Lise Celular
A etapa inicial em qualquer fluxo de trabalho de extração de DNA é a lise celular. Dependendo do tipo de amostra e da pureza exigida, os laboratórios escolhem entre métodos mecânicos, enzimáticos ou à base de detergente. Os detergentes solubilizam as membranas celulares, as ondas ultrassônicas de alta frequência (sonicação) rompem as membranas por meio de cavitação e o batimento das esferas – onde as esferas de vidro vibram contra a amostra – proporciona uma ruptura física rápida que libera ácidos nucleicos.
Abordagens rápidas e sujas
Quando a velocidade supera a pureza, os cientistas às vezes empregam uma limpeza mínima. A adição de proteinaseK degrada a maioria das proteínas, permitindo que a amostra seja usada apenas com uma purificação moderada. Alternativamente, altas concentrações de sal (por exemplo, acetato de amônio ou potássio) precipitam proteínas, mas muitos outros contaminantes permanecem. Estes métodos são adequados para um rastreio rápido, mas são inadequados para aplicações que exigem ADN de alta qualidade.
Extração de fenol-clorofórmio
A extração de fenol-clorofórmio continua sendo uma técnica clássica, embora agora seja menos comum devido à toxicidade e à intensidade do trabalho. As células são lisadas com detergente e depois misturadas com uma mistura de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico. Após a centrifugação, a solução se separa em uma fase aquosa (parte inferior) que retém o DNA e uma fase orgânica (topo) que captura proteínas e lipídios. O controle cuidadoso da concentração de sal e do pH é essencial para uma recuperação ideal. Como o fenol e o clorofórmio são perigosos, muitos laboratórios optaram por alternativas mais seguras.
Cromatografia de troca aniônica
A cromatografia de troca aniônica oferece maior pureza e reprodutibilidade. A matriz da coluna contém grupos carregados positivamente que se ligam ao DNA carregado negativamente. Proteínas, RNA e outros contaminantes são eliminados e o DNA é subsequentemente eluído com um tampão com alto teor de sal. Este método é especialmente valioso para purificação em escala preparativa.
Kits Comerciais
Os kits de coluna giratória à base de sílica tornaram-se o padrão ouro para purificação rápida e reprodutível de DNA. O DNA se liga a uma membrana de sílica na presença de sais caotrópicos, enquanto os contaminantes são removidos. Após um enxágue final com baixo teor de sal, o DNA é eluído em um pequeno volume de TE ou água, produzindo material de alta qualidade em minutos.
Avaliando a Pureza pela Absorvância
Após o isolamento, a solução de DNA é normalmente colocada em um tampão com pH controlado. A sua pureza é verificada medindo a absorvância ultravioleta a 260 nm e 280 nm. Uma proporção de 260/280 de ~1,8 indica alta pureza, enquanto proporções mais baixas sugerem contaminação por proteínas. A absorvância a 260 nm também fornece uma estimativa direta da concentração de DNA.
