Fluxo de trabalho lógico para incorporação de DNA estranho em organismos

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Nos primórdios da engenharia genética, a ideia de enxertar características de um organismo em outro parecia absurda. Hoje, no entanto, a inserção de ADN estranho num genoma hospedeiro é um processo de rotina, seja adicionando genes resistentes a pragas ao milho, expressando insulina humana em bactérias ou modelando cancros humanos em ratos. Embora os detalhes técnicos possam ser complexos, a sequência abrangente de etapas permanece consistente e lógica.

Etapa 1

Comece tratando o DNA plasmídico e o fragmento de DNA estranho com uma enzima de restrição escolhida. Estas enzimas reconhecem motivos de base específicos e fazem cortes precisos, gerando extremidades compatíveis para ligação a jusante. As enzimas de restrição são naturalmente derivadas de sistemas de defesa bacterianos que clivam o DNA viral invasor.

Etapa 2

Em seguida, misture a espinha dorsal do plasmídeo digerido com o DNA estranho clivado e adicione DNA ligase. As extremidades adesivas complementares resultantes se unem e a ligase sela os cortes, produzindo plasmídeos circulares que carregam o segmento de DNA inserido.

Etapa 3

Introduzir os plasmídeos recombinantes em células bacterianas competentes e permitir que se recuperem. As colónias que absorveram o plasmídeo crescerão em meios seletivos contendo o antibiótico apropriado, graças ao marcador de resistência codificado no plasmídeo. A transformação pode ser alcançada através de choque térmico, eletroporação ou competência química, dependendo da cepa bacteriana.

Etapa 4

Colha células de colônias individuais, lise-as com um tampão detergente para liberar DNA plasmídico e, em seguida, desnature os fios por tratamento térmico ou alcalino. Isso prepara o DNA para triagem posterior.

Etapa 5

Hibride o DNA extraído com uma sonda marcada com fluorescência complementar à sequência inserida. Expor a amostra à iluminação UV; regiões de correspondência perfeita emitirão fluorescência, confirmando a presença do gene estranho.

Etapa 6

Selecione colônias que testaram positivo para a inserção, expanda-as e isole o DNA plasmídico. Amplifique o plasmídeo, se necessário, por PCR para gerar material suficiente para análises posteriores ou aplicações a jusante.