Pesquisadores elucidam a estrutura espacial e os mecanismos moleculares do editor principal, uma nova ferramenta de edição de genes
Modelo de superfície do complexo SpCas9 – transcriptase reversa – pegRNA – DNA alvo. O editor principal, composto por um SpCas9 e uma transcriptase reversa, transcreve reversamente a sequência modelo em pegRNA, resultando na incorporação das edições desejadas no local alvo no genoma. O heteroduplex RNA-DNA se forma ao longo do domínio da nuclease RuvC de SpCas9. Crédito:Shuto et al 2024 Uma pesquisa conjunta liderada por Yutaro Shuto, Ryoya Nakagawa e Osamu Nureki, da Universidade de Tóquio, determinou a estrutura espacial de vários processos de uma nova ferramenta de edição genética chamada “editor principal”. A análise funcional baseada nessas estruturas também revelou como um “editor principal” poderia conseguir a transcrição reversa, sintetizando DNA a partir de RNA, sem “cortar” ambas as fitas da dupla hélice.
Esclarecer esses mecanismos moleculares contribui muito para o desenvolvimento de ferramentas de edição genética suficientemente precisas para tratamentos de terapia genética. As descobertas são publicadas na revista Nature .
O Prêmio Nobel de Química de 2020 foi concedido a Jennifer Doudna e Emmanuelle Charpentier por desenvolverem uma maneira inovadora, porém simples, de editar o DNA, o “projeto” dos organismos vivos. Embora a sua descoberta tenha aberto novos caminhos para a investigação, a precisão do método e as preocupações de segurança sobre o "corte" de ambas as cadeias de ADN limitaram a sua utilização em tratamentos de terapia genética. Como tal, pesquisas estão em andamento para desenvolver ferramentas que não apresentem essas desvantagens.
O sistema de edição principal é uma dessas ferramentas, um complexo molecular que consiste em dois componentes. Um componente é o editor principal, que combina uma proteína SpCas9, usada na primeira tecnologia de edição genética CRISPR-Cas, e uma transcriptase reversa, uma enzima que transcreve RNA em DNA.
O segundo componente é o RNA guia de edição principal (pegRNA), um RNA guia modificado que identifica a sequência alvo dentro do DNA e codifica a edição desejada. Nesse complexo, o editor principal funciona como um “processador de texto”, substituindo com precisão as informações genômicas. A ferramenta já foi implementada com sucesso em células vivas de organismos como plantas, peixes-zebra e ratos. No entanto, precisamente como este complexo molecular executa cada etapa do processo de edição não está claro, principalmente devido à falta de informações sobre sua estrutura espacial.
“Ficamos curiosos para saber como a combinação não natural das proteínas Cas9 e da transcriptase reversa funcionam juntas”, diz Shuto, o primeiro autor do artigo. Modelo passo a passo baseado em estrutura do editor principal. Os pares de bases do pegRNA com a fita cortada do DNA alvo para formar o heteroduplex RNA-DNA na superfície do domínio da nuclease RuvC (formação de RNA-DNA). A transcriptase reversa reconhece o heteroduplex RNA-DNA e inicia a transcrição reversa (Iniciação). A transcriptase reversa envolve-se consistentemente na transcrição reversa da sequência modelo em torno do local de iniciação, e o heteroduplex alongado de RNA-DNA acumula-se ao longo da superfície longitudinal de SpCas9, acompanhado pelo rearranjo do duplex de DNA alvo (alongamento). A transcriptase reversa realiza transcrição reversa excessiva além do modelo e encerra a transcrição reversa devido à colisão com Cas9, levando a inserções indesejadas (Terminação). Crédito:Shuto et al 2024 A equipe de pesquisa utilizou microscopia eletrônica criogênica, uma técnica de imagem que possibilita observações em escala quase atômica. O método exigia que as amostras estivessem em gelo vítreo para protegê-las dos danos potenciais dos feixes de elétrons, apresentando alguns desafios adicionais.
“Descobrimos que o complexo do editor principal é instável em condições experimentais”, explica Shuto. “Portanto, foi muito desafiador otimizar as condições para que o complexo permanecesse estável. Durante muito tempo, só conseguimos determinar a estrutura do Cas9.”
Finalmente superando os desafios, os pesquisadores conseguiram determinar a estrutura tridimensional do complexo do editor principal em vários estados durante a transcrição reversa no DNA alvo.
As estruturas revelaram que a transcriptase reversa se ligava ao complexo RNA-DNA que se formava ao longo da “parte” da proteína Cas9 associada à clivagem do DNA, a divisão de uma única fita da dupla hélice. Ao realizar a transcrição reversa, a transcriptase reversa manteve sua posição em relação à proteína Cas9. As análises estruturais e bioquímicas também indicaram que a transcriptase reversa poderia levar a inserções adicionais indesejadas.
Essas descobertas abriram novos caminhos para a pesquisa básica e aplicada. Então, Shuto apresenta os próximos passos.
"Nossa estratégia de determinação de estrutura neste estudo também pode ser aplicada a editores principais compostos por uma proteína Cas9 diferente e transcriptase reversa. Queremos utilizar as informações estruturais recém-obtidas para levar ao desenvolvimento de editores principais aprimorados."
Mais informações: Base estrutural para transcrição reversa guiada por pegRNA pelo editor principal, Nature (2024). DOI:10.1038/s41586-024-07497-8, https://www.nature.com/articles/s41586-024-07497-8 Informações do diário: Natureza
