Imagens representativas de embriões de galinha usados para preparação de RNA e sequenciamento CAGE subsequente. Os painéis superiores mostram embriões no primeiro dia de desenvolvimento embrionário (21 dias no total), equivalente às primeiras cinco semanas de gestação humana (primeiras três semanas de desenvolvimento humano pós-fertilização). Os painéis inferiores mostram embriões desde o estabelecimento do sistema circulatório até cerca de uma semana antes da eclosão, semelhante ao início do terceiro trimestre no desenvolvimento humano. Crédito:Professor Guojun Sheng
A pesquisa de desenvolvimento inicial em embriões humanos é impossível devido a considerações éticas, e é tecnicamente difícil de realizar em outros mamíferos, tornando os recursos para este tipo de pesquisa extremamente raros. Por exemplo, o projeto Functional Annotation of Mammalian Genome (FANTOM) 5 baseado no Japão, estabelecido em 2000, é um projeto colaborativo mundial com o objetivo de identificar todos os elementos funcionais em genomas de mamíferos, mas não tem dados do local de início da transcrição (TSS) com base na Análise Cap de Expressão Gênica (CAGE) para embriões humanos ou para embriões murinos representando estágios iniciais de desenvolvimento.
Para contornar essa escassez de informações, uma colaboração internacional de pesquisadores do Japão (Kumamoto University &RIKEN), Rússia (Universidade Federal de Kazan), Espanha (Universidade da Cantábria), e a Austrália (University of Western Australia) reuniu o primeiro conjunto de TSSs aviários de todo o genoma do mundo. Esses locais marcam o ponto de partida para a transcrição e são extremamente importantes para a diferenciação celular e o desenvolvimento do embrião até o nascimento, ou, no caso de uma espécie aviária, até a eclosão. Embora os pássaros sejam bem diferentes dos humanos, estágios iniciais de desenvolvimento são muito semelhantes, e foi demonstrado que cerca de 60% dos genes codificadores de proteínas humanas têm correspondência um a um com os ortólogos de frango (genes que evoluíram de um ancestral comum).
Usando a tecnologia CAGE, um método altamente confiável para encontrar TSSs e elementos cis-reguladores (aqueles blocos de sequência que regulam a posição e a robustez da transcrição) no genoma durante todo o período de desenvolvimento do pintinho, os colaboradores foram capazes de mapear 60% de todos os TSSs de desenvolvimento de frango para o genoma de frango mais recente, com os outros 40% provavelmente sendo promotores alternativos ainda não caracterizados ou genes de RNA não codificadores. O genoma atualizado foi adicionado ao interativo de RIKEN, plataforma online ZENBU (a palavra japonesa "zenbu" significa "todos" em inglês.) com o nome "Chicken-ZENBU" e é gratuita para todos.
Os pesquisadores também mostraram que o mapeamento TSS de todo o genoma poderia ser aplicado à tecnologia CRISPR-on para ativar genes específicos durante o desenvolvimento, ativando com sucesso o gene T para a proteína Brachyury que codifica no estágio de desenvolvimento HH10 (cerca de 1,5 dias de desenvolvimento após a postura). Essa conquista foi seguida por várias ativações de genes mais bem-sucedidas, mostrando assim a eficácia do CRISPR-on quando combinado com o mapeamento de TSS.
"No processo de desenvolvimento de nosso método de criação de perfil TSS de desenvolvimento baseado em CAGE, identificamos novos fatores de transcrição e seus módulos regulatórios, bem como vários novos genes de manutenção, "disse o líder do projeto, Professor Guojun Sheng, do IRCMS da Universidade de Kumamoto." Esperamos que este trabalho e os dados que adicionamos ao banco de dados online do ZENBU avancem muito a pesquisa de desenvolvimento tanto em aves quanto em mamíferos. "
