Por Palmer Owyoung · Atualizado em 24 de março de 2022

As bactérias são cultivadas em ágar em placas de Petri, formando colônias visíveis que representam grupos de células. Embora uma simples contagem de colônias possa fornecer uma estimativa rápida da carga bacteriana, métodos quantitativos, como contagens de placas viáveis, produzem números absolutos e insights qualitativos sobre como diferentes condições afetam o crescimento. Como uma única placa pode conter bilhões de células, a cultura deve primeiro ser diluída em série até um nível onde as colônias individuais possam ser contadas de forma confiável.

Etapa 1 – Diluição em série

Comece em um tubo estéril de 1,5mL. Pipete 10 µL da cultura inicial em 90 µL de meio de diluição estéril (por exemplo, solução salina tamponada com fosfato). Sele o tubo, agite suavemente no vórtice e você terá uma diluição de 10⁻¹. Repita a transferência de 10 µL para 90 µL frescos de meio para gerar uma diluição de 10⁻² e assim por diante. Continue até atingir uma diluição entre 10⁻⁴ e 10⁻¹⁰. Rotule cada tubo (10‑1, 10‑2, …) para controlar o fator de diluição.

Etapa 2 – Revestimento

Retire 10 µL do tubo mais diluído que ainda produz colônias contáveis (normalmente 30–300 por placa). Espalhe o inóculo uniformemente na superfície do ágar com um espalhador de vidro, gire a placa 90° e repita. Prepare pelo menos três placas por diluição para garantir a confiança estatística. Deixe o espalhador secar sobre uma chama ou bancada por alguns minutos, depois recoloque as tampas e incube na temperatura ideal para o organismo (geralmente 35–37°C) por 12–16h.

Etapa 3 – Contagem de colônias

Após a incubação, inspecione cada placa em busca de um número contável de colônias. Marque o fundo do prato (não a tampa) com um marcador permanente na posição de cada colônia e marque os pontos. Escolha placas que contenham entre 30 e 300 colônias para estatísticas precisas.

Etapa 4 – Cálculo da UFC

Calcule unidades formadoras de colônias (UFC) por mililitro da cultura original usando a fórmula:

UFC/mL = (número de colônias) × 10×10ⁿ

onde n é o expoente negativo do fator de diluição (por exemplo, para uma diluição de 10⁻⁷, n = 7). O fator de 10 representa o volume de inóculo de 10 µL.

Coisas necessárias

• Meio de diluição em série (por exemplo, PBS ou caldo tríptico de soja)
• Pipetas e pontas estéreis
• Tubos de microcentrífuga
• Placas de ágar com meio de crescimento apropriado
• Misturador Vortex
• Queimador de Bunsen
• Espalhadores de vidro
• Etanol 70%

TL;DR

Esterilize o espalhador em etanol 70%, acenda-o com chama de bico de Bunsen, deixe o álcool queimar e resfrie-o na superfície seca do ágar. Isso mata quaisquer micróbios residuais antes do plaqueamento.

Aviso de segurança

Manuseie todas as culturas bacterianas como potencialmente perigosas. Siga as diretrizes institucionais de biossegurança e use equipamento de proteção individual adequado.