Por John Brennan
Atualizado em 24 de março de 2022

A eletroforese em gel continua sendo o carro-chefe dos laboratórios de biologia molecular. Ao aplicar um campo elétrico, o DNA e as proteínas são separados – geralmente por tamanho – dentro de uma matriz de gel. Embora a técnica seja comum, a forma como os resultados são interpretados varia de acordo com a aplicação posterior, seja um Western blot, Northern blot, Southern blot ou uma simples execução em agarose.

Quando você trabalha com géis de agarose, duas tarefas dominam:1) distinguir plasmídeos não cortados, cortados e lineares de sua inserção e 2) estimar tamanhos de fragmentos usando uma curva padrão confiável. As etapas a seguir orientam você nesse processo de maneira clara e reproduzível.

Etapa 1 – Identifique suas pistas

Consulte seu caderno de laboratório para confirmar qual amostra foi carregada em cada pista. Os rótulos de pista que você gravou no momento do carregamento são o ponto de partida para todos os cálculos subsequentes.

Etapa 2 – Localize a escada do DNA

A escada contém fragmentos de comprimento conhecido. Suas distâncias de migração servirão de referência para dimensionar suas bandas desconhecidas.

Etapa 3 – Medir o corante de rastreamento

Usando uma régua, meça a distância do poço até o corante de rastreamento (o corante que viaja mais longe). Registre esse valor; as unidades são arbitrárias desde que sejam consistentes.

Etapa 4 – Determinar a mobilidade relativa

Meça a distância de cada faixa de escada do poço e depois divida pela distância do corante de rastreamento. Isto produz a mobilidade relativa (fator de mobilidade) para cada padrão.

Exemplo:se o corante de rastreamento percorreu 6 polegadas e as faixas da escada percorreram 5, 4,5 e 3,5 polegadas, as mobilidades relativas são 0,833, 0,75 e 0,583.

Etapa 5 – Registrar mobilidade e tamanho

Insira as mobilidades relativas e os tamanhos dos fragmentos correspondentes (em quilobases) em uma planilha. Os fabricantes normalmente fornecem esses tamanhos na folha de dados da escada.

Etapa 6 – Plotar os dados

Crie um gráfico com mobilidade relativa no eixo X e tamanho de fragmento no eixo Y.

Etapa 7 – Ajustar uma curva padrão

Use o recurso Trendline para ajustar uma equação de lei de potência (por exemplo, y =ax^‑2). Procure um R² de pelo menos 0,90 para garantir uma curva confiável.

Etapa 8 – Inspecione as bandas de amostra

Fragmentos menores migram para mais longe. Observe que os plasmídeos superenrolados (sem cortes) viajam mais longe do que fragmentos lineares do mesmo tamanho, enquanto os plasmídeos cortados migram mais lentamente.

Etapa 9 – Combine as bandas com as amostras

Faça referência cruzada das bandas de cada pista com a amostra que você carregou. Para um plasmídeo digerido com duas enzimas, você deverá ver duas faixas distintas:uma próxima ao topo (inserção) e outra próxima à parte inferior (plasmídeo cortado). Uma digestão de enzima única deve produzir uma única banda que viaja um pouco mais longe que o plasmídeo não cortado, mas muito menos que a inserção.

Etapa 10 – Calcular a mobilidade relativa de incógnitas

Meça a distância do poço a cada banda desconhecida, divida pela distância do corante de rastreamento e obtenha a mobilidade relativa.

Etapa 11 – Estimar o tamanho do fragmento

Insira as mobilidades relativas na equação derivada no Passo 7 para calcular o tamanho aproximado de cada fragmento.

Coisas necessárias

• Imagem de gel de alta resolução capturada sob iluminação UV
• Software de planilha (Excel, Planilhas Google etc.)
• Régua ou paquímetro para medição precisa de distância

TL;DR

Se você observar faixas largas e brilhantes perto da parte inferior de cada pista, provavelmente terá contaminação por RNA – revise suas etapas de purificação.