O Tris, ou tris (hidroximetil) aminometano, é um tampão biológico comum, usado durante todo o processo de extração de DNA. Durante a extração de qualquer número de fontes, o DNA é sensível ao pH. Durante a lise celular, remoção de componentes celulares indesejados e precipitação, o tris é usado para manter um pH estável. Além disso, ele desempenha um papel particularmente importante na lise celular.
TL; DR (muito longo; não leu)
A extração de DNA é um processo sensível ao pH e usando um tampão tris ajuda a manter o pH estável durante a lise e a extração das células.
Tris como um tampão
Como o pH pode influenciar e ser influenciado por vários fatores celulares, manter um pH estável é essencial para a ciência experimental. Os tampões biológicos, como o tris, são importantes porque podem manter um pH estável, apesar das influências que poderiam alterar o pH. O tris (hidroximetil) aminometano, com um pKa de 8,1, é um tampão eficaz entre pH 7 e 9. Devido à sua faixa neutra, o tris é um tampão comumente usado em laboratórios biológicos. No entanto, o tampão tris é sensível à temperatura e deve ser usado na temperatura em que foi originalmente pHado para evitar imprecisões.
Lise de células
A lise, ou abrir as células, é o primeiro passo do DNA Extração. Isto é conseguido por um tampão contendo tris e EDTA (ácido etilenodiaminotetracético). O EDTA liga cátions divalentes como cálcio e magnésio. Como esses íons ajudam a manter a integridade da membrana celular, sua eliminação com EDTA desestabiliza a membrana. Tris é o principal componente de buffer; seu principal papel é manter o pH do buffer em um ponto estável, geralmente 8,0. Além disso, o tris provavelmente interage com o LPS (lipopolissacarídeo) na membrana, servindo para desestabilizar ainda mais a membrana.
Tris Protege o DNA das mudanças de pH
Quando as células são separadas, seu DNA e seu conteúdo se derramam. no buffer. Além disso, RNase A (destrói RNA), proteases (destrói proteínas) e SDS (dodecil sulfato de sódio, solubiliza os fragmentos da membrana) são frequentemente incluídos. Tomada em conjunto, esta sopa de conteúdo celular e RNA e proteínas fragmentados pode ter um grande impacto no pH da solução. Como o DNA é sensível ao pH, é importante que o tris tampone a sopa e mantenha o pH em um ponto estável.
Precipitação de DNA
No estágio final da extração do DNA, o próprio DNA é extraído do solução. Neste ponto, o DNA é solúvel no tampão. Para extrair da solução, o DNA é tornado insolúvel pela adição de etanol ou isopropanol (álcool isopropílico). Quando isso é feito, o DNA se torna óbvio em solução como uma substância branca. Embora o DNA possa ser isolado dos componentes celulares restantes dessa maneira, ele não é "utilizável" quando é insolúvel. Após o isolamento, o álcool é removido e o DNA deve ser devolvido a um tampão biológico, como o tris, para ser usado.
Faça você mesmo
Embora a extração do DNA seja geralmente feita em laboratórios de pesquisa, geralmente usando um de vários kits disponíveis comercialmente, qualquer um pode fazer a extração de DNA em casa usando utensílios domésticos comuns e ervilhas ou espinafres. Nesse caso, o tris, nem qualquer tampão biológico, não está presente para proteger o DNA das alterações de pH. No entanto, é uma maneira visual de ajudar os alunos a se conectarem com o DNA celular.
