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    Show de luzes em células vivas:novo método permite marcação fluorescente simultânea de muitas proteínas
    Imagens de microscopia de fluorescência de pools vpCell. Crédito:Andreas Reicher

    Observar proteínas precisamente dentro das células é extremamente importante para muitos ramos de pesquisa, mas tem sido um desafio técnico significativo – especialmente em células vivas, já que a marcação fluorescente necessária tinha que ser anexada individualmente a cada proteína.



    O grupo de pesquisa liderado por Stefan Kubicek no CeMM já superou esse obstáculo:com um método chamado “vpCells”, é possível rotular muitas proteínas simultaneamente, usando cinco cores fluorescentes diferentes. Esta abordagem automatizada de alto rendimento, auxiliada pelo reconhecimento de imagem assistido por IA, abre aplicações inteiramente novas em diversas disciplinas, desde a biologia celular fundamental até a descoberta de medicamentos. O estudo foi publicado na revista Nature Cell Biology .

    Sem proteínas, a vida como a conhecemos seria inconcebível. Eles fornecem a estrutura estrutural das células, atuam como enzimas para controlar o metabolismo e permitem que as células se comuniquem com seu ambiente como receptores de membrana, transportadores ou moléculas sinalizadoras. Todas essas funções só podem ser cumpridas se as proteínas estiverem localizadas no lugar certo dentro da célula. Muitas vezes, até mesmo as propriedades de uma proteína mudam quando ela muda de localização – portanto, o controle sobre sua localização na célula também significa controle sobre sua função.

    Para compreender e explorar a função das proteínas, é essencial determinar e rastrear com precisão a sua localização dentro da célula. As proteínas muitas vezes se deslocam dinamicamente entre diferentes organelas e compartimentos da célula. Para visualizá-los ao microscópio, eles são frequentemente ligados a um componente proteico fluorescente e brilhante. No entanto, este método enfrentou dificuldades técnicas:normalmente, o componente fluorescente só poderia ser ligado a uma proteína de cada vez, e para marcar múltiplas proteínas, as células geralmente tinham que ser mortas e fixadas.
    Crescimento de um pool vpCell. Crédito:(c) Andreas Reicher/Jiri Reinis

    O novo método apresentado pelo grupo de Stefan Kubicek, denominado "células de proteômica visual" (abreviado como vpCells), permite que as proteínas sejam marcadas com fluorescência de uma forma que preserve seus mecanismos reguladores endógenos. Em vez de rotular uma proteína por vez, os vpCells podem fundir muitas proteínas simultaneamente com uma etiqueta fluorescente em uma abordagem chamada multiplex.

    Um precursor desse método já foi descrito pela equipe de Kubicek em 2020 para estudar enzimas metabólicas. Agora foi ampliado e melhorado de três maneiras:

    Em primeiro lugar, o vpCells pode rotular todas as proteínas teoricamente possíveis usando a ferramenta de edição de genes CRISPR/Cas9 para anexar geneticamente proteínas fluorescentes às proteínas sob investigação. O grupo de Kubicek criou uma “biblioteca” genômica para esse fim, permitindo a marcação fluorescente e a exploração funcional sistemática de todas as proteínas humanas possíveis.

    Em segundo lugar, os vpCells usam não apenas uma cor fluorescente, mas um total de cinco cores complementares. Em cada célula, duas proteínas diferentes a serem rastreadas são marcadas. Além disso, outra marcação colorida é usada para distinguir melhor os clones individuais. E mais duas cores marcam o núcleo e a membrana da célula para delinear melhor as células individuais.

    Em terceiro lugar, este esquema de cores permite não só gerar imagens visualmente atraentes, mas também reconhecer e discriminar opticamente as diferentes proteínas. Normalmente, isso requer sequenciamento complexo de DNA após a imagem para determinar qual proteína está marcada. A abordagem vpCells, por outro lado, permite treinar um sistema de reconhecimento de imagem assistido por IA para reconhecer qual proteína está marcada em qual célula com base apenas em imagens de microscopia de fluorescência.
    Imagens de microscopia de fluorescência de pools vpCell. Crédito:Andreas Reicher

    O método já demonstrou a sua utilidade em duas aplicações:Por um lado, mais de 4.500 linhas celulares foram geradas como repórteres para mais de 1.100 proteínas. Estas linhas celulares foram utilizadas para treinar os modelos de IA e para descrever a localização das proteínas no seu estado basal. Todas as imagens das proteínas rotuladas individuais estão disponíveis no banco de dados da web de acesso público vpCells.

    Por outro lado, as células repórteres vivas foram utilizadas para uma questão de investigação específica:a equipa de Kubicek examinou o efeito de mais de 1000 substâncias de moléculas pequenas em 61 proteínas relevantes para as células cancerígenas. Os pesquisadores descobriram que 44 das substâncias testadas alteraram a quantidade ou localização de proteínas individuais em 6 horas. Uma das substâncias revelou-se um inibidor do transporte de proteínas do núcleo celular, que tem efeito semelhante a um medicamento clinicamente aprovado para o mieloma múltiplo, um cancro do sistema formador do sangue.

    “Esses resultados fornecem uma primeira visão da versatilidade do método vpCells”, diz Kubicek. “Esperamos muito mais aplicações futuras, desde a biologia celular fundamental até a descoberta aplicada de medicamentos”.

    Mais informações: Marcação multicolorida agrupada para visualizar a dinâmica das proteínas subcelulares, Nature Cell Biology (2024). DOI:10.1038/s41556-024-01407-w
    Informações do diário: Biologia Celular da Natureza

    Fornecido pelo Centro de Pesquisa CeMM para Medicina Molecular da Academia Austríaca de Ciências



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