Biólogos sintéticos da Rice University desenvolveram a primeira tecnologia para observar a atividade em tempo real de alguns dos circuitos de processamento de sinais mais comuns em bactérias, incluindo patógenos mortais que usam os circuitos para aumentar sua virulência e desenvolver resistência a antibióticos.
Sistemas de dois componentes são circuitos sensoriais que as bactérias usam para reagir ao ambiente e sobreviver. As bactérias usam os circuitos, que também são conhecidos como vias de transdução de sinal, para sentir uma "faixa incomparável de estímulos" de luz e íons metálicos a pH e até mensagens de seus amigos e vizinhos, disse o professor de bioengenharia da Rice, Jeffrey Tabor.

A nova ferramenta óptica de Tabor e pesquisador de pós-doutorado Ryan Butcher para observar reações de fosforilação em tempo real em sistemas de dois componentes é descrita em um estudo publicado esta semana na revista Proceedings of the National Academy of Sciences .

“As bactérias usam sistemas de dois componentes para ativar a virulência e a resistência a antibióticos, colonizar hospedeiros humanos e vegetais, formar biofilmes e dispositivos médicos sujos”, disse Tabor, professor de bioengenharia e biociências.

O laboratório de Tabor estuda sistemas de dois componentes há anos. Em 2019, sua equipe revelou um kit de ferramentas de biohacking que os biólogos sintéticos poderiam usar para misturar e combinar dezenas de milhares de entradas sensoriais e saídas genéticas dos circuitos.

Um dos usos mais importantes desse kit de ferramentas foi desvendar o duplo mistério dos sistemas de dois componentes. Como o próprio nome indica, os circuitos têm duas funções:detectar um estímulo fora da célula e alterar o comportamento da célula em resposta a esse estímulo.

O primeiro componente, conhecido como sensor quinase, normalmente se projeta através da parede externa da célula e só pode ser ativado por um sinal químico específico. Uma vez acionado, desencadeia uma cascata bioquímica, uma reação em cadeia dentro da célula que termina com a célula mudando seu comportamento em resposta aos estímulos.

O primeiro passo na cascata é um processo chamado fosforilação, que resulta na ativação do segundo componente do sistema, o regulador de resposta.

Embora as reações de fosforilação sejam fundamentais nas dezenas de milhares de sistemas de dois componentes empregados em bactérias, tem sido muito difícil observá-las diretamente em bactérias vivas. Isso ocorre em parte porque os reguladores de resposta geralmente devem se unir para formar pares para continuar a cascata biológica que leva à resposta ao estímulo.

"A análise experimental de fosforilação muitas vezes requer purificação de proteínas de bactérias e análise usando métodos laboriosos in vitro, como eletroforese em gel", disse Butcher.

Butcher criou um método muito mais simples que usa marcadores de proteínas fluorescentes e luz fluorescente polarizada. Ele projetou cepas de E. coli para produzir sondas de proteína fluorescente mNeonGreen que despolarizam a luz de um laser de excitação, mas apenas se interagem como pares. Em uma variedade de testes, Butcher e Tabor mostraram que seu método pode ser usado para monitorar a magnitude e a velocidade da ativação do regulador de resposta sob uma variedade de condições ambientais.

O método é chamado de "transferência de energia de ressonância de fluorescência homotípica", ou homo-FRET para abreviar. Tabor disse que os pesquisadores podem usá-lo para acompanhar a ativação de sistemas de dois componentes com resolução de tempo muito maior do que era possível anteriormente.

No estudo, ele e Butcher demonstraram a utilidade do homo-FRET observando um sistema de dois componentes ativado por nitrato que é conhecido por desempenhar um papel na colonização gastrointestinal por E. coli, Salmonella e outros patógenos.

"Os microbiologistas sabem há algum tempo que esse circuito genético é usado por vários patógenos, mas ainda não entendemos completamente como ele funciona", disse Tabor.

Usando seu método, Tabor e Butcher descobriram um pulso de atividade não relatado anteriormente no circuito em resposta à adição de nitrato. O pulso parece surgir devido à rápida ativação do sistema de dois componentes seguido pelo consumo de nitrato pelas bactérias e a correspondente desativação.

"Essa é uma janela para como esse circuito funciona, e é o tipo de coisa que teria sido muito mais difícil de definir usando métodos anteriores", disse Tabor. "Com o homo-FRET, podemos observar o circuito responder às mudanças nos níveis de nitrato à medida que estão acontecendo."

"Acreditamos que o homo-FRET pode ser usado para projetar biossensores que respondem 10 vezes mais rápido do que as alternativas atuais, e que nós e outros poderemos usá-lo para fazer novas descobertas em várias outras vias bacterianas", disse ele. + Explorar mais

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