Uma equipe de pesquisadores interdisciplinares liderada pela Penn State desenvolveu técnicas para melhorar a eficiência do CRISPR-Cas9, a técnica de edição de genoma que ganhou o Prêmio Nobel em 2020. Embora o CRISPR-Cas9 seja mais rápido, menos caro e mais preciso do que outras edições de genes métodos, de acordo com o líder do projeto Xiaojun "Lance" Lian, professor associado de engenharia biomédica e biologia na Penn State, a tecnologia tem limitações, especialmente em aplicações para melhorar a saúde humana.
Os pesquisadores desenvolveram um processo mais eficiente e acessível para aplicar sistemas CRISPR-Cas9 em células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs), derivadas de linhas de células-tronco aprovadas pelo governo federal, que Lian disse que poderia avançar muito no diagnóstico e tratamento de distúrbios genéticos. A abordagem foi publicada em 7 de setembro em Métodos de relatórios de células .

CRISPR-Cas9, que significa repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente interespaçadas e proteína 9 associada a CRISPR, oferece aos cientistas a capacidade de direcionar locais precisos do código genético para alterar o DNA, oferecendo oportunidades para criar novas ferramentas de diagnóstico e mutações potencialmente corretas para tratar causas genéticas de doença.

“O genoma humano é enorme, e o CRISPR-Cas9 possibilita que os cientistas encontrem e alvejem um gene mutante com o objetivo de estudá-lo”, disse Lian.

O CRISPR usa um disco de material genético, conhecido como DNA plasmidial, para fornecer ácido ribonucleico (RNA) guiado que posiciona a enzima Cas9 no local preciso do gene alvo. Quando o DNA é localizado, Cas9 se liga a ele e o corta, permitindo que outro DNA repare o corte. Os pesquisadores podem então ver como a remoção altera a expressão do gene. Mas existem problemas de eficiência de entrega e edição com os atuais métodos CRISPR baseados em DNA, de acordo com Lian.

"A entrega de efetores de DNA CRISPR é baixa", disse ele. "Apenas 20% a 30% das células-alvo receberão DNA de edição de genes ao usar o CRISPR. A entrega de RNA nas células pode ser mais eficiente; no entanto, quando o RNA regular é introduzido, as células podem vê-lo como um vírus. Eles destroem o RNA antes que ele possa produzir proteínas – digamos, em questão de algumas horas – e, ao fazê-lo, destruir a tentativa de edição genética”.

Para melhorar o resultado, os pesquisadores mudaram a forma como as ferramentas de edição do genoma são entregues às células-tronco, usando RNA modificado (modRNA). O modRNA difere do DNA plasmidial, pois substitui um dos substratos básicos encontrados no RNA por uma versão modificada quimicamente e é estabilizado por um suporte estrutural mais forte.

"Descobriu-se que o modRNA é notavelmente mais eficiente do que o DNA plasmidial", disse Lian. "Cerca de 90% das células receberam o modRNA de uma simples transfecção, então ele foi capaz de permanecer no lugar e fazer seu trabalho."

Os pesquisadores também descobriram que a quantidade de tempo que o modRNA estava no lugar era ideal:tempo suficiente para modificar as células, mas não tanto que causasse atividade fora do alvo. Mas o modRNA introduziu outro problema, de acordo com Lian.

Quando o modRNA Cas9 é entregue com sucesso ao gene alvo, ele cria uma quebra de fita dupla no genoma, que algumas células tentarão consertar. Os que se consertam podem passar o reparo, ou "mutação", para seus descendentes. Este é o processo que os pesquisadores querem entender melhor, então essas são as células que eles querem colher e estudar. A questão, disse Lian, é que a maioria das células com essa quebra a identifica como um grande problema com o genoma e se autodestruirá em vez de tentar se reparar.

Para reduzir os efeitos colaterais tóxicos do Cas9 e ajudar as células editadas a sobreviver, a equipe de Lian introduziu uma pequena proteína conhecida por ajudar as células a crescer. De acordo com Lian, essa proteína adicionada inibiu a morte celular e melhorou a eficiência de edição de Cas9 em até 84%.

Os pesquisadores também descobriram que o modRNA pode melhorar outras técnicas de edição de genes, como a edição de base. A edição de base pode eliminar genes ou corrigir mutações no genoma usando uma proteína para alterar um único nucleotídeo em vez de cortar ambas as fitas, como o CRISPR faz.

"Nós transfectamos células-tronco com uma proteína de edição de base baseada em plasmídeo ou baseada em modRNA", disse Lian. "Nosso método baseado em modRNA foi mais de quatro vezes mais eficiente, em 68%, do que a técnica baseada em plasmídeo, em cerca de 16%, na edição do genoma com sucesso."

De acordo com Lian, à medida que mais laboratórios de edição genética melhoram a eficiência e eficácia da edição genética, os pesquisadores poderão entender melhor os genes e suas funções mais rapidamente.

"O corpo humano tem mais de 20.000 genes, mas estudamos as funções de apenas cerca de 10% deles", disse Lian. "Examinar o propósito de cada gene remanescente, um de cada vez, pode levar uma vida inteira. O uso de células-tronco projetadas de nossas técnicas altamente eficientes de edição de genes pode acelerar muito esse processo". + Explorar mais

Estudar doenças com melhor entrega de ferramentas de edição de genes