Um método projetado baseado em CRISPR que encontra RNA do SARS-CoV-2, o vírus que causa o COVID-19, promete tornar os testes para essa e outras doenças rápidos e fáceis.
Colaboradores da Rice University e da University of Connecticut projetaram ainda mais o sistema CRISPR-Cas13 de edição de RNA para aumentar seu poder para detectar quantidades mínimas do vírus SARS-CoV-2 em amostras biológicas sem a demorada etapa de extração e amplificação de RNA necessária para teste de PCR padrão-ouro.

A nova plataforma foi muito bem-sucedida em comparação com a PCR, encontrando 10 de 11 positivos e nenhum falso positivo para o vírus em testes em amostras clínicas diretamente de zaragatoas nasais. Os pesquisadores mostraram que sua técnica encontra sinais de SARS-CoV-2 em attomolar (10 ^-18 ) concentrações.

O estudo liderado pelo engenheiro químico e biomolecular Xue Sherry Gao na Escola de Engenharia George R. Brown de Rice e pelos pesquisadores de pós-doutorado Jie Yang de Rice e Yang Song de Connecticut aparece em Nature Chemical Biology .

Cas13, como seu primo mais conhecido Cas9, faz parte do sistema pelo qual as bactérias naturalmente se defendem contra fagos invasores. Desde sua descoberta, o CRISPR-Cas9 foi adaptado por cientistas para editar genomas de DNA vivos e mostra grande promessa de tratar e até curar doenças.

E pode ser usado de outras maneiras. O Cas13 por si só pode ser aprimorado com RNA guia para encontrar e cortar sequências de RNA alvo, mas também para encontrar "colateral", neste caso a presença de vírus como o SARS-CoV-2.

"A proteína Cas13 projetada neste trabalho pode ser facilmente adaptada a outras plataformas previamente estabelecidas", disse Gao. "A estabilidade e a robustez das variantes Cas13 projetadas as tornam mais adequadas para diagnósticos no ponto de atendimento em áreas de configuração de poucos recursos quando máquinas de PCR caras não estão disponíveis."

Yang disse que o Cas13 de tipo selvagem, extraído de uma bactéria, Leptotrichia wadei, não pode detectar nível attomolar de RNA viral dentro de um período de 30 a 60 minutos, mas a versão aprimorada criada em Rice faz o trabalho em cerca de meia hora e detecta SARS -CoV-2 em concentrações muito mais baixas do que os testes anteriores.

Ela disse que a chave é um loop de grampo flexível e bem escondido perto do local ativo do Cas13. "Está no meio da proteína perto do sítio catalítico que determina a atividade do Cas13", disse Yang. "Como o Cas13 é grande e dinâmico, foi um desafio encontrar um site para inserir outro domínio funcional."

Os pesquisadores fundiram sete domínios de ligação de RNA diferentes ao loop, e dois dos complexos foram claramente superiores. Quando encontrassem seus alvos, as proteínas fluoresciam, revelando a presença do vírus.

"Podemos ver que o aumento da atividade foi cinco ou seis vezes maior que o Cas13 do tipo selvagem", disse Yang. "Esse número parece pequeno, mas é bastante surpreendente com uma única etapa de engenharia de proteínas.

"Mas isso ainda não foi suficiente para a detecção, então mudamos todo o ensaio de um leitor de placas de fluorescência, que é bastante grande e não está disponível em configurações de poucos recursos, para um sensor eletroquímico, que tem maior sensibilidade e pode ser usado para pontos diagnóstico de cuidados", disse ela.

With the off-the-shelf sensor, Yang said the engineered protein was five orders of magnitude more sensitive in detecting the virus compared to the wild-type protein.

The lab wants to adapt its technology to paper strips like those in home COVID-19 antibody tests, but with much higher sensitivity and accuracy. "We hope that will make testing more convenient and with lower cost for many targets," Gao said.

The researchers are also investigating improved detection of the Zika, dengue and Ebola viruses and predictive biomarkers for cardiovascular disease. Their work could lead to rapid diagnosis of the severity of COVID-19.

"Different viruses have different sequences," Yang said. "We can design guide RNA to target a specific sequence that we can then detect, which is the power of the CRISPR-Cas13 system."

But because the project began just as the pandemic took hold, SARS-CoV-2 was a natural focus. "The technology is quite amenable to all the targets," she said. "This makes it a very good option to detect all kinds of mutations or different coronaviruses."

"We are very excited about this work as a combinational effort of structure biology, protein engineering and biomedical device development," Gao added. "I greatly appreciate all the efforts from my lab members and collaborators."

Co-authors of the paper are Rice postdoctoral researcher Xiangyu Deng, undergraduate Jeffrey Vanegas and graduate student Zheng You; graduate students Yuxuan Zhang and Zhengyan Weng of the University of Connecticut; microbiology supervisor Lori Avery and Kevin Dieckhaus, a professor of medicine, of UConn Health; Yi Zhang, an assistant professor of biomedical engineering at the University of Connecticut; and Yang Gao, an assistant professor of biosciences at Rice. + Explorar mais

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