p Os cientistas da Johns Hopkins desenvolveram um método simplificado e acompanham "regras" de eficiência para a introdução de novas sequências de DNA nas células depois de usar a ferramenta de corte de genes conhecida como CRISPR. Os cientistas dizem que o método, que eles basearam em testes com embriões de camundongos e milhares de células humanas, poderia melhorar a consistência e eficiência da edição do genoma. p O novo método e seu desenvolvimento são descritos online no dia 28 de novembro no Proceedings of the National Academy of Sciences .

p "CRISPR é uma ferramenta para ajudar os cientistas a modificar o genoma, prever o resultado de certas características e estudá-las, mas a própria ferramenta só cria rupturas no genoma. Não controla como uma nova sequência de DNA é inserida no genoma, "diz Geraldine Seydoux, Ph.D., o Professor Huntington Sheldon em Descoberta Médica no Departamento de Biologia Molecular e Genética e vice-reitor de pesquisa básica na Escola de Medicina da Universidade Johns Hopkins, e um investigador do Howard Hughes Medical Institute.

p "Começamos a estudar como as células reparam quebras induzidas por CRISPR com o objetivo de usar o processo de reparo natural do DNA da célula para introduzir novas sequências no genoma. Ficamos surpresos ao descobrir que as células copiarão prontamente sequências de DNA estranho para reparar quebras de DNA. , contanto que os DNAs estranhos sejam lineares, "Seydoux acrescenta." Ao estudar como fragmentos de DNA estranho são copiados durante o processo de reparo, criamos algumas regras simples para tornar a edição do genoma o mais eficiente possível, otimize a ferramenta, e faça isso com confiança. "

p CRISPR, que significa repetição palindrômica curta regularmente interespaçada agrupada, ganhou popularidade entre os cientistas nos últimos cinco anos como uma ferramenta para cortar DNA com eficiência. Ele foi adaptado para uso em células de mamíferos a partir de um processo de defesa viral natural em células bacterianas que envolve a criação de cortes letais no DNA viral. Essencialmente, a ferramenta é um conjunto simplificado de "tesouras" moleculares.

p A crença predominante, entre os cientistas, é que as células reparam quebras de DNA inserindo um conjunto aleatório de nucleotídeos, os blocos de construção químicos do DNA. Isso geralmente destrói qualquer gene localizado no local onde o DNA foi quebrado.

p Também é bem conhecido dos cientistas que, ocasionalmente, as células usam uma fonte diferente - uma sequência de outro pedaço de DNA, ou DNA "doador" - para selar a quebra no DNA. Contudo, a nova sequência "doadora" não pode ser inserida sozinha em um espaço vazio do genoma.

p Em vez de, o novo DNA doador precisa de uma espécie de fita em cada extremidade para ajudá-lo a aderir à lacuna feita pelo corte. Os cientistas se referem a essa fita como os braços de "homologia" do DNA do doador.

p Os braços de homologia consistem em nucleotídeos que se sobrepõem às porções intactas do DNA com código genético correspondente. Isso ajuda o DNA do doador a "grudar" no DNA intacto.

p Ainda, cientistas consideraram o uso de DNA de doadores uma forma ineficiente de reparar o genoma, assumindo que requer longos braços de homologia, especialmente ao inserir uma longa sequência de DNA, e DNA de fita simples ou circular, que são difíceis de preparar em tamanhos longos.

p À medida que os cientistas ganharam mais experiência com o CRISPR, Seydoux diz, "Surgiram questões sobre as regras de design ideais para DNA de doadores e o comprimento dos braços de homologia."

p Buscando respostas para essas perguntas, os cientistas da Johns Hopkins inseriram várias combinações de DNA de doador em células renais embrionárias humanas, conhecido por sua capacidade de crescer bem e por seu uso frequente na pesquisa do câncer. Os cientistas usaram DNA de doadores com um gene que codifica uma proteína fluorescente, que brilha em verde na membrana nuclear da célula quando a inserção do gene é bem-sucedida.

p Alexandre Paix, pesquisador associado da Johns Hopkins, descobriu que fragmentos de DNA linear funcionam muito bem como doadores, e são duas a cinco vezes mais eficientes do que os DNAs circulares (conhecidos como plasmídeos) em células humanas. "O DNA linear é muito fácil de preparar em laboratório, usando PCR, "diz Paix, referindo-se a ferramentas de reação em cadeia da polimerase, que são usados ​​para amplificar o DNA.

p Paix também testou vários comprimentos de braços de homologia. Ele descobriu que o ponto ideal para braços de homologia é de cerca de 35 nucleotídeos de comprimento, muito mais curto do que os cientistas normalmente usam.

p Especificamente, verificou-se que os braços de homologia de 33 a 38 nucleotídeos de comprimento foram tão bem-sucedidos quanto aqueles com 518 nucleotídeos, produzindo entre 10 e 20 por cento de edições bem-sucedidas em condições ideais. Em contraste, quando os cientistas testaram braços de homologia de 15 e 16 nucleotídeos de comprimento, as taxas de sucesso de inserção caíram pela metade. Eles repetiram esses resultados em três locais diferentes do genoma humano.

p Eles também descobriram que a sequência recém-inserida, sem contar os braços de homologia, pode ser até 1, 000 nucleotídeos de comprimento.

p A equipe alcançou taxas de sucesso entre 10 e 50 por cento com inserções variando de 57 a 993 nucleotídeos de comprimento. Seqüências mais curtas foram inseridas com mais sucesso do que as mais longas. Por exemplo, novas sequências que foram 57, 714 e 993 nucleotídeos de comprimento foram inseridos com sucesso 45,4, 23,5 e 17,9 por cento do tempo, respectivamente. Além de 1, 000 nucleotídeos, novas inserções com 1, 122 e 2, 229 nucleotídeos tiveram pouco sucesso - cerca de 0,5 por cento das vezes. "Nesse tamanho, torna-se muito difícil introduzir a quantidade de DNA do doador necessária para a edição. As células tendem a se "sufocar" com tanto DNA, "diz Seydoux.

p Finalmente, a equipe também descobriu que a taxa de sucesso de edição atinge o pico quando a nova sequência é posicionada dentro de 30 nucleotídeos do local de corte CRISPR. "Além de 30 nucleotídeos, a inserção não é viável, "diz Seydoux.

p "Esses parâmetros devem acomodar a maioria dos genes que os cientistas estão tentando editar. Na verdade, a maioria dos experimentos envolve a edição de apenas dois a três nucleotídeos perto do local de corte CRISPR, "acrescenta Seydoux.

p A equipe de pesquisa também testou se a mesma abordagem poderia funcionar em embriões de camundongos. Usando um fragmento de PCR com braços de homologia de 36 nucleotídeos, a equipe inseriu com sucesso uma sequência de 739 nucleotídeos codificando uma proteína fluorescente em 27 de 87 (31 por cento) embriões de camundongos.

p A equipe de pesquisa de Seydoux já está usando as regras de reparo para estudar o DNA em Caenorhabditis elegans, uma espécie de verme, e os pesquisadores estão estudando se as regras de reparo se aplicam a outros tipos de células humanas.

p Antes que as diretrizes sejam amplamente adotadas, Seydoux diz que eles deveriam ser testados em mais tipos de células humanas e outros organismos.