Uma célula de fibroblasto de camundongo fotografada em uma metassuperfície feita de nanopartículas de ouro sob um microscópio de fluorescência de reflexão interna total (TIRF) exibe emissão aprimorada e confinada da proteína paxilina emissora de luz em adesões focais perto da membrana. Pesquisadores da Universidade de Kyushu mostraram que essas metassuperfícies podem ser usadas com microscópios de fluorescência convencionais como uma rota simples para melhorar a resolução para perto do limite de difração. O uso de condições TIRF ajuda a reduzir a emissão parasita de dentro da célula para melhorar ainda mais o contraste das estruturas próximas à metassuperfície. Crédito:Kaoru Tamada, Universidade Kyushu
Na busca por imagens de estruturas e fenômenos extremamente pequenos com maior precisão, os cientistas estão empurrando os limites da resolução do microscópio óptico, mas esses avanços geralmente vêm com complicações e custos aumentados.
Agora, pesquisadores no Japão mostraram que uma superfície de vidro incorporada com nanopartículas de ouro automontadas pode melhorar a resolução com pouco custo adicional, mesmo usando um microscópio de campo amplo convencional, facilitando a microscopia de fluorescência de alta resolução, capaz de gerar imagens em alta velocidade de células vivas.
Como os microscópios ópticos ampliam a luz para obter imagens detalhadas de uma estrutura, o tamanho dos objetos que podem ser distinguidos há muito tempo é limitado pela difração - uma propriedade da luz que faz com que ela se espalhe ao passar por uma abertura.
Os pesquisadores têm desenvolvido técnicas para superar esses limites com sistemas ópticos altamente avançados, mas muitos deles dependem do uso de lasers fortes, que pode danificar ou até matar células vivas, e digitalização da amostra ou processamento de várias imagens, que inibe a geração de imagens em tempo real.
"Técnicas recentes podem produzir imagens impressionantes, mas muitos deles requerem equipamento altamente especializado e são incapazes de observar o movimento das células vivas, "diz Kaoru Tamada, distinto professor do Instituto de Química e Engenharia de Materiais da Universidade de Kyushu.
Células de imagem usando métodos de microscopia de fluorescência em tempo real, Tamada e seu grupo descobriram que podiam melhorar a resolução em um microscópio de campo amplo convencional para perto do limite de difração apenas mudando a superfície sob as células.
Na microscopia de fluorescência, estruturas celulares de interesse são marcadas com moléculas que absorvem energia da luz que entra e, através do processo de fluorescência, reemitir como luz de uma cor diferente, que é coletado para formar a imagem.
Embora as células geralmente sejam fotografadas em vidro simples, O grupo de Tamada revestiu a superfície do vidro com uma camada automontada de nanopartículas de ouro coberta com uma fina camada de dióxido de silício, criando uma chamada metassuperfície com propriedades ópticas especiais.
Apenas 12 nm de diâmetro, as nanopartículas de metal organizadas exibem um fenômeno conhecido como ressonância de plasmon de superfície localizada, que permite que a metassuperfície colete energia de moléculas emissoras de luz próximas para reemissão altamente eficiente, produzindo assim uma emissão melhorada confinada à superfície das nanopartículas de 10 nm de espessura.
Uma célula de fibroblasto de camundongo fotografada em uma metassuperfície feita de nanopartículas de ouro sob um microscópio de fluorescência de campo amplo exibe emissão aprimorada e confinada da proteína paxilina emissora de luz em adesões focais perto da membrana. Pesquisadores da Universidade de Kyushu mostraram que essas metassuperfícies podem ser usadas com microscópios de fluorescência convencionais como uma rota simples para melhorar a resolução para perto do limite de difração. A iluminação da amostra perpendicular à metassuperfície permite que o corpo celular seja aproximadamente visto como uma emissão fraca, enquanto a imagem da paxilina é considerada pontos brilhantes. Crédito:Kaoru Tamada, Universidade Kyushu
"Ao introduzir as nanopartículas, criamos efetivamente um plano emissor de luz com apenas vários nanômetros de espessura, "explica Tamada." Porque a luz de interesse é emitida por uma camada tão fina, podemos nos concentrar melhor nisso. "
Benefícios adicionais surgem da transferência de energia para a metassuperfície sendo rápida, localizando ainda mais os pontos de emissão, reduzindo a difusão, e o alto índice de refração da metassuperfície, o que ajuda a melhorar a resolução de acordo com o limite de difração de Abbe.
Usando a metassuperfície, os pesquisadores capturaram imagens em células de camundongos em tempo real conhecidas como fibroblastos 3T3, que foram geneticamente modificadas para produzir uma proteína chamada paxilina, que é modificada para emitir luz verde quando excitada. Paxillin desempenha um papel fundamental na criação de adesões focais - pontos onde as moléculas da membrana celular interagem com o mundo exterior.
Iluminar toda a amostra com luz laser perpendicular à superfície, os pesquisadores conseguiram imagens de mudanças na paxilina perto da membrana celular com uma resolução mais alta usando a metassuperfície em vez de vidro.
Inclinando a luz de iluminação para alcançar a reflexão interna total, os pesquisadores puderam obter imagens com contraste ainda maior porque a maior parte da luz de iluminação é refletida na superfície com apenas uma pequena quantidade atingindo o lado da célula, reduzindo assim a emissão perdida produzida pela iluminação que penetra profundamente na célula.
A análise das imagens gravadas a cada 500 milissegundos com uma câmera digital de super resolução revelou diferenças claras na intensidade sobre os pontos que cobrem apenas alguns pixels, indicando que a resolução era de cerca de 200 nm - perto do limite de difração.
As células também podem ser visualizadas por mais tempo na metassuperfície porque a emissão foi aumentada apesar de uma entrada de energia mais baixa, reduzindo assim o dano celular ao longo do tempo.
“Metasuperfícies são uma opção promissora para melhorar a resolução para pesquisadores de todo o mundo usando microscópios ópticos convencionais que eles já possuem, "comenta Tamada.
Além de continuar melhorando as superfícies para uso com microscópios convencionais, os pesquisadores também estão explorando as vantagens que podem ter para sistemas de microscópio mais sofisticados.
