Por Anne Mullenniex Atualizado em 24 de março de 2022

Quantifique sua amostra de RNA medindo sua absorvância de luz ultravioleta (UV). Um espectrofotômetro nano-gota usará apenas um ou dois microlitros de sua amostra, que você pode recuperar. Outros espectrofotômetros requerem uma amostra muito maior. O coeficiente de extinção para nucleótidos num comprimento de onda UV de 260 nm num caminho de luz de 1 cm é 20. Com base neste coeficiente de extinção, a absorvância de 40 µg/ml de ARN nas mesmas condições é um. Usando essas informações, você pode calcular a concentração da sua amostra de RNA.

Etapa 1

Faça uma diluição, se necessário, da sua amostra. Uma diluição padrão para uma microcuveta é 1:40. Faça esta diluição adicionando 2 µL de amostra de RNA a 78 µL de água estéril.

Etapa 2

Siga os protocolos do seu espectrofotômetro específico para calibrar a máquina usando um branco e depois determine a densidade óptica da sua amostra em um comprimento de onda UV de 260 nm.

Etapa 3

Multiplique a absorbância da sua amostra pelo seu fator de diluição por 40μg RNA/mL. A equação seria:"Concentração de RNA (µg/ml) =(OD260) x (fator de diluição) x (40µg RNA/ml)/(1 unidade OD260)" (Hofstra.edu) Por exemplo:Se você diluiu sua amostra em 1:40 e sua leitura de absorbância foi 0,08, você multiplicaria 0,08 x 40 x 40 =128 µg/ml =0,13 µg/μL

Etapa 4

Descubra a pureza da sua amostra fazendo outra leitura de absorbância no comprimento de onda UV de 280 nm. A relação DO 260/DO 280 indicará se – e em que nível – a sua amostra está contaminada com proteína ou fenol. Um resultado de 1,8 a 2,0 indica RNA de qualidade.

Coisas necessárias

• Espectrofotômetro
• Calculadora

TL;DR (muito longo; não li)

Não se esqueça de calibrar seu espectrofotômetro. A execução de um gel eletroforético rápido confirmará os resultados das especificações.

Aviso

Não presuma que sua amostra é pura. Reservar um tempo para obter uma relação OD260/OD280 economiza tempo e dinheiro no futuro.