Determinando a temperatura ideal para atividade enzimática

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Por Tricia Lobo, Atualizado em 30 de agosto de 2022

As enzimas aceleram as reações químicas, diminuindo a energia de ativação. A maioria das enzimas tem melhor desempenho entre 35°C e 40°C, uma faixa onde o aumento da energia cinética aumenta a ligação do substrato sem causar desnaturação. Exceder esta janela pode desdobrar irreversivelmente a proteína e interromper a atividade.

Etapa 1:escolha um ensaio quantitativo

Selecione um método confiável para quantificar a formação de produto em cada ponto de temperatura. As opções comuns incluem espectrofotometria – conversão de absorbância em concentração usando uma curva de calibração – ou ensaios de fluorescência que correlacionam a intensidade com a quantidade do produto.

Etapa 2:preparar o sistema de reação

Combine enzima e substrato em um frasco de cintilação selado para evitar a evaporação. Coloque o frasco em um copo maior com água e monte o copo em uma placa de aquecimento. Insira um termômetro calibrado no copo para monitorar a temperatura da solução com precisão.

Etapa 3:amostragem em toda a faixa de temperatura

Comece por colher uma alíquota de 100 µL à temperatura ambiente (~25°C). Ative a placa de aquecimento e colete amostras de 100 µL em temperaturas incrementais — 30,5 °C, 31 °C, 31,5 °C, etc. — até atingir 40 °C. Certifique-se de que cada amostra seja processada imediatamente para evitar desvios de temperatura.

Etapa 4:analisar a concentração do produto

Determine a concentração do produto para cada alíquota usando o ensaio escolhido. Plote a concentração (ou taxa de reação) versus temperatura. O pico desta curva identifica a temperatura ideal da enzima. Temperaturas acima de 40°C normalmente mostram um declínio na atividade, indicando início de desnaturação.