Protocolo para ensaio de nitrato redutase usando nitrito de sódio como padrão

Este protocolo descreve um método comum para medir a atividade da nitrato redutase usando nitrito de sódio como padrão.

Materiais:

* Material vegetal: Folhas frescas, raízes ou outros tecidos contendo nitrato redutase.
* Buffer de extração:
* Buffer Tris-HCl de 100 mm, pH 7,5
* 1 mm EDTA
* 10 mm DTT (ditiotreitol)
* 0,1% (p/v) albumina sérica bovina (BSA)
* Mistura de reação :
* Tampão de fosfato de potássio de 100 mm, pH 7,5
* Nitrato de sódio de 10 mm
* 1 mm NADH
* Solução padrão de nitrito de sódio: Prepare uma solução padrão de concentração conhecida (por exemplo, 100 ppm).
* reagente Griess: (Consulte instruções de protocolo específicas)
* espectrofotômetro : Para medir a absorvância a 540 nm.
* centrífuga: Para separar detritos celulares.
* Banho de gelo: Manter temperaturas frias.
* pipetas e dicas: Para medições precisas de volume.

Procedimento:

1. Preparação da amostra:
* Colhe o material vegetal e enxágue rapidamente com água destilada fria.
* Pese uma quantidade adequada de tecido (por exemplo, 0,1-1 g) e moa-o em um argamassa e pilão com nitrogênio líquido ou usando um homogeneizador em tampão de extração.
* Centrifugar o homogenato a 10.000 g por 10 minutos a 4 ° C para remover detritos celulares. O sobrenadante é o seu extrato de enzima.

2. Ensaio de nitrato redutase:
* Prepare uma série de tubos que contêm a mistura de reação, incluindo espaços em branco sem extrato de enzima, e tubos com concentrações variadas de padrão de nitrito de sódio.
* Adicione um volume apropriado de extrato enzimático aos tubos de reação.
* Inicie a reação adicionando NADH.
* Incubar os tubos a 30 ° C por um tempo específico (por exemplo, 30 minutos).
* Encerrar a reação adicionando o reagente Griess.

3. Medição da produção de nitrito:
* Incubar os tubos no escuro por pelo menos 15 minutos para permitir o desenvolvimento de cores.
* Meça a absorvância a 540 nm usando um espectrofotômetro.
* Prepare uma curva padrão usando as concentrações conhecidas de nitrito de sódio.
* Calcule a quantidade de nitrito produzida pelo extrato da enzima usando a curva padrão.

4. Cálculo da atividade da nitrato redutase:
* Expresse a atividade da nitrato redutase como µmoles de nitrito produzido por minuto por grama de peso fresco (FW) ou proteína .

Nota:

* Este protocolo é um esboço básico e modificações específicas podem ser necessárias, dependendo das espécies vegetais e da configuração experimental.
* Certifique -se de que todas as soluções sejam preparadas frescas e armazenadas adequadamente.
* Use reagentes de alta qualidade para obter resultados precisos.
* Controle para absorvância de fundo medindo a absorvância de espaços em branco sem extrato de enzima.
* Repita o ensaio pelo menos três vezes para garantir a reprodutibilidade.

reagente Griess:

* O reagente Griess é usado para detectar nitrito, reagindo com ele para produzir um corante azo de cor roxa.
* Os diferentes reagentes da Griess podem ser usados; portanto, consulte o protocolo específico para preparação e uso.

Métodos alternativos:

* Outros métodos para medir a atividade da nitrato redutase incluem o uso de nitrato como substrato e detectar a redução do nitrato em nitrito.
* medição espectrofotométrica pode ser empregado para medir diretamente a mudança na concentração de NADH ao longo do tempo.

Interpretação:

A atividade da nitrato redutase é um indicador da capacidade da planta de reduzir o nitrato ao nitrito, que é uma etapa crucial na assimilação de nitrogênio. Comparar a atividade em diferentes tecidos ou em diferentes condições pode revelar informações valiosas sobre o metabolismo de nitrogênio da planta.

Mais informações:

* Modificações de protocolo para espécies ou condições específicas de plantas: Consulte a literatura científica relevante ou especialistas em contato para obter orientação.
* Solução de problemas: Consulte os guias de solução de problemas ou consulte especialistas se encontrar algum problema com o ensaio.

Este protocolo fornece uma estrutura geral para medir a atividade da nitrato redutase usando nitrito de sódio como padrão. Adapte -o às suas necessidades específicas e garanta resultados precisos.