Nanomáquinas de proteína feitas de várias moléculas de proteína são altamente dinâmicas durante suas ações em seus alvos funcionais, às vezes chamados de substratos. A dinâmica dessas grandes nanomáquinas de proteína de peso molecular superior a megadalton é refratária à análise estrutural por tecnologia existente, como cristalografia de raios-X e espectroscopia de ressonância magnética nuclear. Microscopia crioeletrônica (crio-EM), uma tecnologia emergente para determinação de estrutura de alta resolução, tem potencial para visualizar a dinâmica de grandes nanomáquinas de proteínas, mas as reconstruções crio-EM existentes de estruturas altamente dinâmicas foram limitadas a moderada a baixa resolução.

Os cientistas há muito sonham em decodificar a dinâmica de grandes máquinas moleculares de tamanhos megadalton em detalhes atômicos, o determinante final de suas funções biológicas. Agora, uma equipe de biofísicos da Universidade de Pequim, O Dana-Farber Cancer Institute e a Harvard Medical School usaram crio-EM para visualizar a dinâmica de nível atômico do proteassoma de 2,5 megadalton, a maior máquina conhecida de degradação de proteínas em células eucarióticas, durante sua ação quimio-mecânica sobre um substrato protéico. Eles reconstruíram um procedimento dinâmico quase completo de processamento de substrato no proteassoma humano em resolução sem precedentes que permitiu a determinação de detalhes atômicos em 3-D, semelhante a filmar um filme 3-D átomo por átomo.

"Este trabalho abre caminho para estudar a termodinâmica de nanomáquinas megadalton com precisão atômica longe do equilíbrio, "disse Youdong Mao, um biofísico e autor correspondente em um novo artigo inovador publicado na primeira edição da revista Natureza em 2019. "Este estudo abre inúmeras possibilidades para a descoberta de drogas baseadas na estrutura visando o proteassoma humano para o tratamento de mieloma múltiplo e doenças neurodegenerativas."

O sistema ubiquitina-proteassoma (UPS) é a via de degradação de proteínas mais importante nas células. Ele mantém o equilíbrio dos materiais proteicos nas células vivas, e desempenha um papel crucial na rápida degradação de proteínas regulatórias, proteínas mal dobradas ou proteínas danificadas. A UPS está envolvida em todos os processos celulares, indiscutivelmente, como o ciclo celular, regulação da expressão gênica e assim por diante. O metabolismo anormal da proteína causado pelo distúrbio do UPS está diretamente relacionado a muitas doenças humanas, incluindo o câncer. Em 2004, Aaron Ciechanover, Irwin Rose e Avram Hershko receberam o Prêmio Nobel de Química por sua descoberta dessa via de degradação. No coração do UPS está o proteassoma responsável pela quebra de substratos marcados com ubiquitina. É uma das gigantescas máquinas holoenzimáticas mais fundamentais e complicadas das células. A holoenzima proteassoma humana contém pelo menos 33 tipos diferentes de subunidades com um peso molecular total de cerca de 2,5 megadalton. Também é conhecido como o alvo direto de vários medicamentos de pequenas moléculas aprovados pelo FDA dos Estados Unidos para o tratamento do mieloma múltiplo.

Usando cryo-EM em combinação com tecnologia de aprendizado de máquina, a equipe determinou as estruturas dinâmicas do proteassoma humano envolvido no substrato em sete estados conformacionais intermediários com resolução de 2,8-3,6 Å, capturado durante a quebra de uma proteína poliubiquitilada. Nesta resolução, a equipe foi capaz de identificar íons de magnésio únicos ligados a ATP e ADP nos mapas de densidade crio-EM. Essas estruturas 3-D iluminam um notável continuum espaço-temporal de interações dinâmicas substrato-proteassoma.

Curiosamente, a equipe descobriu que a iniciação da translocação do substrato é amplamente coordenada com outros eventos regulatórios dinâmicos que preparam o proteassoma para a degradação processiva do substrato. Por meio de análises sistemáticas adicionais, a equipe descobriu como a energia química da hidrólise do ATP é convertida no trabalho mecânico do substrato que se desdobra por meio de um processo altamente coordenado de mudanças conformacionais multiproteicas.

Sua descoberta fornece novos insights sobre o ciclo completo de processamento de substrato e sugere modos distintos seguidos pela hidrólise de ATP na holoenzima do proteassoma. Acredita-se ser a primeira vez que um ciclo completo de hidrólise sequencial de ATP em um motor heterohexamérico AAA-ATPase foi visualizado em nível atômico. Isso resolve um antigo debate científico sobre hexâmeros de ATPase entre dois modelos hipotéticos, um sugerindo hidrólise sequencial de ATP e o outro assumindo eventos hidrolíticos aleatórios no anel hexamérico. Notavelmente, a equipe observou três modos principais de hidrólise de ATP altamente coordenada, apresentando eventos hidrolíticos em duas ATPases posicionadas de forma oposta, em duas ATPases adjacentes, e em uma ATPase de cada vez. Esses modos hidrolíticos regulam elegantemente a desubiquitilação, iniciação de translocação, e desdobramento processivo de substratos, respectivamente.

A equipe observou certas limitações neste estudo, incluindo que a multiplicidade de eventos de processamento de nucleotídeos em ATPases distintas durante as transições entre os estados consecutivos do proteassoma pode ter resultado na ausência de etapas rápidas e estados intermediários escassamente povoados em suas reconstruções crio-EM. A equipe prevê a perspectiva de mais explorações a esse respeito, identificando esses intermediários ausentes para esclarecer como os eventos hidrolíticos de ATP e a troca de nucleotídeos são coordenados entre si, e alostericamente ligada à translocação do substrato. "É necessário um maior desenvolvimento da tecnologia de análise de dados para extrair informações ainda mais dinâmicas do mesmo conjunto de dados, "Mao disse." Há um longo caminho a percorrer para que a tecnologia de aprendizado de máquina baseada em dados libere totalmente o poder potencial do crio-EM na solução de dinâmicas complexas de máquinas moleculares de megadalton. "