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As membranas celulares são compostas por bicamadas fosfolipídicas com proteínas incorporadas que medeiam funções celulares essenciais. A microscopia óptica tradicional não consegue resolver proteínas de membrana individuais. A fratura por congelamento, combinada com a microscopia eletrônica, nos permite dividir as membranas congeladas ao longo de sua bicamada, expondo a distribuição de proteínas dentro da matriz lipídica. Ao integrar técnicas de rotulagem adicionais, os investigadores podem mapear proteínas específicas, bem como componentes bacterianos e virais, com precisão subnanométrica.

Etapas básicas na fratura por congelamento

1. Congele rapidamente células ou tecidos em nitrogênio líquido para imobilizar estruturas.

2. Use um micrótomo para fraturar a amostra congelada; a membrana se cliva entre os dois folhetos fosfolipídicos onde as interações hidrofóbicas são mais fracas.

3. Execute a gravação por congelamento em alto vácuo para remover cristais de gelo, preservando detalhes finos.

4. Sombreie a face da fratura com uma fina película de carbono e platina para criar uma réplica estável que siga a topologia da membrana.

5. Digerir o material orgânico residual com ácido, deixando uma casca de platina que representa a superfície exposta da membrana.

6. Examine a réplica por microscopia eletrônica de transmissão (TEM) para análise estrutural.

Gravação Congelada

A gravação por congelamento remove cristais de gelo que, de outra forma, obscureceriam os detalhes da membrana. O processo de secagem a vácuo preserva a arquitetura nativa e permite a observação de atividades dinâmicas de membrana, organelas intracelulares e montagens virais.

Microscopia Eletrônica

A microscopia eletrônica de transmissão oferece ampliação de até 1 milhão de vezes e resoluções de até 3 nm, tornando-a a modalidade preferida para réplicas de fratura por congelamento. A microscopia eletrônica de varredura (MEV) é menos comumente usada neste contexto, mas pode fornecer topologia de superfície de amostras maiores.

Revelando a estrutura da membrana celular

Desde a sua introdução, há mais de cinco décadas, o TEM da fratura por congelamento tem sido fundamental na confirmação do modelo de bicamada lipídica da membrana plasmática e na elucidação do arranjo espacial de proteínas integrais, periféricas e ancoradas em lipídios. A técnica revela se as proteínas são “moscas volantes” que flutuam dentro da bicamada ou “âncoras” que abrangem ambos os folhetos, e pode detectar agregação ou agrupamento de proteínas. Quando combinada com a marcação com imunogold – anticorpos marcados com partículas eletrodensas – os pesquisadores podem identificar proteínas específicas e inferir suas funções funcionais.