Por Dianne Hermance, atualizado em 30 de agosto de 2022

Eletroforese em gel – Uma visão geral

A eletroforese em gel é uma técnica fundamental em biologia molecular que separa ácidos nucléicos e proteínas com base no tamanho e na carga. Ao aplicar um campo elétrico através de uma matriz de gel, as moléculas carregadas migram a taxas inversamente proporcionais ao seu comprimento, permitindo uma estimativa precisa do tamanho.

Preparando o Gel

O meio mais comum é a agarose, um polissacarídeo purificado derivado de algas marinhas. A agarose forma uma rede porosa que permite que moléculas de diferentes tamanhos atravessem em velocidades distintas. Para fragmentos menores que ~200bp, um gel de poliacrilamida oferece maior resolução, embora exija um manuseio cuidadoso devido às suas propriedades neurotóxicas.

Antes de despejar, a solução de gel é misturada com um corante intercalante – tradicionalmente brometo de etídio (EtBr) – que apresenta fluorescência sob iluminação UV quando ligado ao DNA. Os protocolos modernos empregam cada vez mais alternativas mais seguras, como SYBRSafe ou GelRed, embora a um custo mais elevado.

Durante a moldagem do gel, um pente cria poços que são posteriormente preenchidos com amostra misturada com um corante de carga. O corante acompanha o progresso da amostra e adiciona densidade para evitar a difusão.

Executando o Gel

Depois que o gel solidifica, ele é submerso em um tampão de corrida compatível. Os poços são carregados com amostras de DNA ou proteínas e uma escada de DNA – um conjunto de fragmentos com tamanhos conhecidos – é colocada em um poço de referência. Uma tensão constante (normalmente 80–120 V) conduz as moléculas carregadas negativamente em direção ao eletrodo positivo.

Visualização e Interpretação de Bandas

Após a eletroforese, o gel é exposto a um transiluminador UV. As bandas correspondentes ao DNA ou RNA apresentam fluorescência; bandas de proteína podem ser visualizadas usando coloração com Coomassie ou prata. A distância de migração de cada banda é comparada com a escada para deduzir o tamanho dos fragmentos, enquanto a intensidade da banda indica a concentração relativa.

O manuseio cuidadoso do EtBr ou de suas alternativas é essencial, pois esses compostos podem se intercalar no DNA e, no caso do EtBr, são considerados mutagênicos.

Garantindo a qualidade dos dados

Resultados de alta qualidade dependem de uma preparação meticulosa do gel:usando tampões recém-preparados e livres de RNase; garantindo espessura uniforme do gel; e evitando contaminação cruzada entre amostras. Faixas limpas e bem resolvidas, sem manchas, indicam uma separação bem-sucedida e análises posteriores precisas.

Aplicativos

A eletroforese em gel sustenta uma ampla gama de aplicações – desde impressão digital de DNA na ciência forense até avaliação de produtos de PCR, clonagem de fragmentos e verificação de pureza de proteínas. A interpretação confiável dos dados eletroforéticos é, portanto, crítica tanto para a pesquisa quanto para o diagnóstico clínico.