Por Palmer Owyoung
Atualizado em 30 de agosto de 2022

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O código genético de uma célula reside em seu DNA, que permanece trancado no núcleo. Para estudar a expressão genética ou para gerar bibliotecas complementares de DNA (cDNA), o DNA deve primeiro ser transcrito em RNA mensageiro (mRNA). O isolamento de mRNA de alta qualidade é essencial para detectar transcrições raras, projetar sondas de microarranjos e construir bibliotecas de cDNA.

Isolamento de mRNA do RNA total

Etapa 1 – Homogeneização do TRIzol

Comece ressuspendendo as células sedimentadas no Reagente TRIzol (Life Technologies) ou em uma solução equivalente de fenol-guanidina, como o Reagente TRI da Ambion. Este reagente lisa simultaneamente células, desnatura proteínas e protege o RNA da degradação enzimática.

Etapa 2 – Isolamento total de RNA

Execute uma série de centrifugações para separar os componentes celulares em fases distintas. Descarte a camada superior amarela e rica em gordura. Colete a fase aquosa vermelha, que contém a população completa de RNA (mRNA, tRNA, rRNA e RNAs não codificantes). Siga o protocolo de extração com fenol-clorofórmio e depois lave o pellet de RNA com isopropanol e etanol. Adicione inibidores de RNase para preservar a integridade do RNA.

Etapa 3 – Extração de mRNA

Os kits comerciais fornecem a purificação de mRNA mais reprodutível. As escolhas populares incluem o FastTrack 2.0 da Invitrogen e o kit de isolamento de mRNA Poly(A)Pure da Ambion. Um protocolo de kit típico funciona da seguinte forma:

• Combine até 300 µL de RNA total com o tampão de lise inibido por RNase do kit.
• Aqueça a 65°C por 5 minutos e depois esfrie no gelo.
• Adicione NaCl 0,5M e dissolva o oligo‑dT (ácido oligodesoxitimidílico) fornecido na mistura.
• Centrifugar e recuperar o sobrenadante; liga o mRNA à matriz de sílica fornecida.
• Lave repetidamente com tampão de ligação com baixo teor de sal e depois com tampão de lavagem.
• Eluir o mRNA no volume especificado (normalmente ~500µL).
• Precipite o eluato com acetato de sódio e etanol e, em seguida, ressuspenda em 10–20 µL de água tratada com DEPC.
• Armazene a –80°C e avalie a concentração e a pureza usando um espectrofotômetro UV.

Coisas necessárias

• Gabinete de fluxo laminar
• Equipamento de proteção individual (jaleco, luvas, proteção para os olhos)
• Pipetas, ponteiras, recipientes para descarte de risco biológico
• Centrífuga de alta velocidade, bloco térmico
• Superfícies de bancada sem RNA
• Reagentes RNAzap ou RNAoff
• Kits comerciais de extração de mRNA (Invitrogen, Ambion, etc.)
• Acetato de sódio, etanol, isopropanol
• Água tratada com DEPC
• Espectrofotômetro UV e consumíveis
• Células adequadas para extração de RNA
• TRIzol ou reagente TRI
• Inibidores de RNase

TL;DR

Mantenha todos os reagentes, células e RNA extraído frio, colocando-os no gelo. Condições frias inibem a atividade da RNase liberada durante a homogeneização.

Aviso

TRIzol e reagentes similares de fenol-guanidina são tóxicos. Evite o contato com a pele e mucosas e siga rigorosamente os protocolos de segurança institucionais.

Referências

• “Protocolos de Biblioteca de cDNA”; Ian G. Cowell e Caroline A. Austin, 1997
• “Protocolos de transcrição e tradução in vitro”; Martin J. Tymms, 1995