Por Sarah Quinlan
Atualizado em 30 de agosto de 2022

De acordo com o BioWeb da Universidade de Wisconsin, um primer de PCR é um oligonucleotídeo sintético curto – normalmente com 18 a 25 nucleotídeos de comprimento – usado para amplificar segmentos específicos de DNA por meio da reação em cadeia da polimerase (PCR). Tanto os iniciadores directos como os iniciadores inversos, concebidos como complementos inversos, flanqueiam a região alvo para facilitar a amplificação. Quando os pesquisadores têm como alvo um gene específico ou região de DNA, a PCR gera material suficiente para análises posteriores. Se primers adequados não estiverem disponíveis na literatura publicada ou em fontes comerciais, o design de primers personalizados torna-se essencial.

Etapa 1

Comece recuperando a sequência de nucleotídeos do seu gene alvo ou região do DNA e decida o comprimento do fragmento que deseja amplificar. A PCR convencional amplifica fragmentos entre 100 e 1.000 pares de bases, enquanto a PCR em tempo real normalmente tem como alvo 50 a 200 pares de bases.

Etapa 2

Determine onde seus primers se ligarão na sequência - perto da extremidade 5' ou 3', no meio ou abrangendo um íntron, se desejado.

Etapa 3

Aderir às diretrizes estabelecidas de design de primers; o sucesso da amplificação depende da qualidade do primer e dos parâmetros principais.

Etapa 4

Projete primers com 18 a 24 nucleotídeos de comprimento. O Dr. Vincent R. Prezioso, Ph.D., da Brinkmann Instruments recomenda esta linha para especificidade ideal e recozimento eficiente. Almeje uma temperatura de fusão (Tm) de 55–80°C, um conteúdo de GC de 40–60% e um grampo de GC na extremidade 3′. Evite três ou mais bases G/C nas últimas cinco posições para reduzir ligações não específicas.

Etapa 5

Evite execuções de quatro ou mais nucleotídeos idênticos ou repetições de dinucleotídeos, pois isso pode levar a uma preparação incorreta. Certifique-se de que não existe nenhuma complementaridade intra-primer ou inter-primer que possa formar autodímeros ou dímeros de primer.

Etapa 6

Use ferramentas on-line confiáveis - Primer3 do MIT , Primer-Blast do NCBI e OligoAnalyzer do IDT —para avaliar propriedades de primers e prever estruturas secundárias.

Coisas necessárias

• Sequência de nucleotídeos da região alvo do DNA
• Software ou site de design Primer