Proteínas da membrana interna e proteínas da membrana externa em E. coli

Proteínas da membrana interna (IMPs) :Essas proteínas são incorporadas na membrana interna de E. coli, uma bicamada fosfolipídica que envolve o citoplasma. Eles desempenham papéis cruciais em várias funções celulares, incluindo:

* Transporte: Facilitar o movimento de nutrientes, íons e resíduos em toda a membrana.
* Transdução do sinal : Retransmitir sinais do meio ambiente para o interior da célula.
* Metabolismo de energia: Participando de processos como transporte de elétrons e síntese de ATP.

proteínas da membrana externa (omps) :Essas proteínas estão localizadas na membrana externa de E. coli, uma segunda bicamada fosfolipídica que envolve a membrana interna e fornece suporte e proteção estruturais. Eles estão envolvidos em:

* Formação da porina: Criando canais que permitem a passagem de pequenas moléculas.
* Atividade do receptor: Ligação a moléculas específicas e respostas celulares desencadeadas.
* adesão: Ligando a superfícies ou outras células.

Separando as proteínas da membrana interna e externa de E. coli

Aqui está uma abordagem geral para separar esses tipos de proteínas de E. coli:

1. Lise celular:

* lise mecânica: Use métodos como sonicação ou imprensa francesa para interromper a parede celular e liberar o conteúdo da célula.
* lise química: Utilize detergentes como Triton X-100 ou SDS para dissolver os lipídios da membrana.

2. Centrifugação diferencial:

* centrifugação de baixa velocidade (10.000 x g): Esta etapa remove detritos celulares, incluindo células ininterruptas e grandes componentes celulares.
* centrifugação de alta velocidade (100.000 x g): Esta etapa separa as membranas internas e externas do citoplasma solúvel. O pellet contendo ambas as membranas é coletado.

3. Fracionamento da membrana:

* Centrifugação de gradiente de sacarose: Este método separa as membranas com base em sua densidade. A membrana externa é tipicamente menos densa que a membrana interna, permitindo sua separação.
* Triton X-114 Fase Partioning: Esta técnica usa um detergente não iônico para separar as proteínas com base em sua hidrofobicidade. Os IMPs são mais hidrofóbicos que os OMPs, levando a sua partição na fase rica em detergente.

4. Purificação:

* cromatografia de afinidade: Essa técnica utiliza ligantes específicos que se ligam à proteína alvo, permitindo sua separação de outras proteínas.
* Cromatografia em troca de íons: Este método separa proteínas com base em sua carga.
* Cromatografia de exclusão de tamanho: Essa técnica separa proteínas com base em seu tamanho.

5. Confirmação:

* SDS-PAGE: Essa técnica de eletroforese separa proteínas com base em seu peso molecular.
* Western blotting: Esta técnica usa anticorpos para detectar proteínas específicas.

Notas importantes:

* O protocolo específico dependerá da proteína alvo e de suas propriedades.
* A otimização de cada etapa é crucial para obter proteína pura e funcional.
* Técnicas como espectrometria de massa podem ser usadas para análises adicionais das frações proteicas separadas.

kits comerciais:

Vários kits comerciais estão disponíveis para isolar as proteínas da membrana interna e externa de E. coli, o que pode simplificar o processo.

Seguindo estas etapas e escolhendo as técnicas apropriadas, os pesquisadores podem separar e purificar com sucesso as proteínas da membrana interna e externa de E. coli, permitindo uma análise mais aprofundada de sua estrutura, função e interações.