A transcrição é unidirecional devido à assimetria inerente da dupla hélice do DNA. Cada fita de DNA tem uma direcionalidade específica, conhecida como direção 5' para 3'. Essa direcionalidade é determinada pela orientação das ligações fosfodiéster que ligam os nucleotídeos na estrutura do DNA.

Durante a transcrição, a RNA polimerase, a enzima responsável pela síntese do RNA, lê o molde de DNA na direção de 5' para 3'. Essa direcionalidade é crucial porque a RNA polimerase só pode adicionar nucleotídeos à crescente cadeia de RNA na direção 5' para 3'.

A unidirecionalidade da transcrição garante que os transcritos de RNA sejam sintetizados na orientação correta, com a extremidade 5' correspondendo ao início do gene e a extremidade 3' correspondendo ao final do gene. Desvios deste processo unidirecional, como a transcrição bidirecional ou a presença de sequências intervenientes, podem resultar na formação de transcritos de RNA não funcionais ou truncados.

A unidirecionalidade da transcrição também tem implicações para a regulação genética. Vários mecanismos reguladores, tais como sequências promotoras, intensificadores e terminadores, funcionam de uma maneira específica da sequência para controlar a iniciação, o alongamento e a terminação da transcrição, respectivamente. Esses elementos reguladores são reconhecidos e utilizados pela RNA polimerase na direção adequada de 5' para 3', permitindo o controle preciso da expressão gênica.