p Os cientistas do Broad Institute e do MIT, que primeiro utilizaram o CRISPR para a edição do genoma de mamíferos, desenvolveram um novo sistema molecular para a edição eficiente do RNA em células humanas. Edição de RNA, que pode alterar produtos genéticos sem fazer alterações no genoma, tem profundo potencial como ferramenta tanto para pesquisa quanto para tratamento de doenças. p Em um artigo publicado hoje em Ciência , o autor sênior Feng Zhang e sua equipe descrevem o novo sistema baseado em CRISPR, chamado de Edição de RNA para Substituição Programável de A a I, ou "REPARAR." O sistema pode alterar nucleosídeos de RNA simples em células de mamíferos de maneira programável e precisa. REPAIR tem a capacidade de reverter mutações causadoras de doenças no nível do RNA, bem como outras aplicações potenciais de ciências terapêuticas e básicas.

p "A capacidade de corrigir mutações causadoras de doenças é um dos principais objetivos da edição do genoma, "disse Zhang, membro do instituto central do Broad Institute e investigador do Instituto McGovern para Pesquisa do Cérebro do MIT. "Até aqui, nos tornamos muito bons em inativar genes, mas, na verdade, recuperar a função proteica perdida é muito mais desafiador. Esta nova capacidade de editar RNA abre mais oportunidades potenciais para recuperar essa função e tratar muitas doenças, em quase qualquer tipo de célula. "

p REPAIR tem a capacidade de direcionar letras individuais de RNA, ou nucleosídeos, troca de adenosinas por inosinas (lidas como guanosinas pela célula). Essas letras estão envolvidas em mudanças de base única que costumam causar doenças em humanos. Na doença humana, uma mutação de G para A é extremamente comum; essas alterações foram implicadas em, por exemplo, casos de epilepsia focal, Distrofia muscular de Duchenne, e doença de Parkinson. REPAIR tem a capacidade de reverter o impacto de qualquer mutação G-para-A patogênica, independentemente de sua sequência de nucleotídeos circundante, com potencial para operar em qualquer tipo de célula.

p Ao contrário das mudanças permanentes no genoma necessárias para a edição do DNA, A edição de RNA oferece uma forma mais segura, forma mais flexível de fazer correções na célula. "REPAIR pode corrigir mutações sem alterar o genoma, e porque o RNA se degrada naturalmente, é uma correção potencialmente reversível, "explicou o co-primeiro autor David Cox, um estudante de pós-graduação no laboratório de Zhang.

p Para criar REPAIR, os pesquisadores traçaram sistematicamente o perfil da família de enzimas CRISPR-Cas13 para potenciais candidatos a "editor" (ao contrário de Cas9, as proteínas Cas13 visam e cortam o RNA). Eles selecionaram uma enzima da bactéria Prevotella, chamado PspCas13b, qual foi o mais eficaz na inativação de RNA. A equipe projetou uma variante desativada do PspCas13b que ainda se liga a trechos específicos de RNA, mas não possui sua atividade "semelhante à tesoura", e fundiu-o a uma proteína chamada ADAR2, que muda o nucleosídeo adenosina para inosina em transcritos de RNA.

p Em reparo, a enzima Cas13b desativada busca uma sequência alvo de RNA, e o elemento ADAR2 realiza a conversão de nucleosídeos sem cortar a transcrição ou depender de qualquer maquinaria nativa da célula.

p A equipe modificou ainda mais o sistema de edição para melhorar sua especificidade, reduzindo edições fora do alvo detectáveis ​​de 18, 385 a apenas 20 em todo o transcriptoma. A encarnação atualizada, REPAIRv2, Conseguiu consistentemente a edição desejada em 20 a 40 por cento - e até 51 por cento - de um RNA alvo, sem sinais de atividade fora do alvo significativa. "O sucesso que tivemos ao projetar este sistema é encorajador, e há sinais claros de que REPAIRv2 pode ser evoluído ainda mais para uma atividade mais robusta, mantendo a especificidade, "disse Omar Abudayyeh, co-primeiro autor e aluno de pós-graduação no laboratório de Zhang.

p Para demonstrar o potencial terapêutico do REPAIR, a equipe sintetizou as mutações patogênicas que causam anemia de Fanconi e diabetes insípido nefrogênico ligado ao X, os introduziu em células humanas, e corrigiu com sucesso essas mutações no nível do RNA. Para impulsionar as perspectivas terapêuticas, a equipe planeja melhorar a eficiência do REPAIRv2 e empacotá-lo em um sistema de entrega apropriado para a introdução do REPAIRv2 em tecidos específicos em modelos animais.

p Os pesquisadores também estão trabalhando em ferramentas adicionais para outros tipos de conversões de nucleosídeos. “Há uma imensa diversidade natural nessas enzimas, "disse o co-primeiro autor Jonathan Gootenberg, um estudante de graduação no laboratório de Zhang e no laboratório do membro do Broad core institute, Aviv Regev. "Estamos sempre procurando aproveitar o poder da natureza para realizar essas mudanças."

p Zhang, junto com o Broad Institute e MIT, planejam compartilhar o sistema REPAIR amplamente. Tal como acontece com as ferramentas CRISPR anteriores, os grupos tornarão essa tecnologia disponível gratuitamente para pesquisas acadêmicas por meio da página do laboratório de Zhang no site de compartilhamento de plasmídeo Addgene, através do qual o laboratório Zhang já compartilhou reagentes mais de 42, 000 vezes com pesquisadores em mais de 2, 200 laboratórios em 61 países, acelerando a pesquisa em todo o mundo.