Em reações químicas catalisadas por uma enzima, a enzima reduz a quantidade de energia de ativação requerida pela ligação temporária com o substrato e sua torção em um estado de tensão. O k (catalisador) ou "kcat" para a reação refere-se à constante independente da concentração para a taxa na qual uma enzima particular pode metabolizar um substrato em uma molécula de produto. Para calcular kcat, os cientistas primeiro misturam vários tubos de ensaio com concentrações variáveis ​​de substrato (conhecido como "ensaio enzimático") e os testam em intervalos de tempo constantes com um espectrofotômetro de luz para medir as concentrações crescentes de moléculas de produto. Esses dados são plotados em um gráfico e analisados.

Calculando as velocidades iniciais

Faça um gráfico da concentração do produto versus tempo para os dados do primeiro tubo de ensaio do ensaio enzimático. Observação: o eixo horizontal deve ser "tempo" e o eixo vertical deve ser "concentração de produto".

Calcule a linha de regressão linear para os pontos de dados que você plotou na Seção 1, Etapa 1. Enquanto Excel e gráficos calculadoras podem facilmente determinar este modelo linear, você pode derivar uma estimativa da inclinação da linha de regressão dividindo a diferença na concentração do produto entre pontos de dados adjacentes pela sua diferença no tempo.

Registre a inclinação da linha de regressão linear de Seção 1, Etapa 2 como "velocidade de reação inicial (Vo)". Nota: no modelo da linha de regressão "[concentração do produto] = m [tempo] + b," o coeficiente "m" é a inclinação.

Repita os passos 1, 2 e 3 para o resto dos tubos de ensaio no ensaio.

Calculando Vmax

Trace o inverso da concentração de substrato para cada tubo de ensaio versus o inverso de sua velocidade inicial de reação (da Seção 1, Etapa 4). Por exemplo, se a velocidade inicial para um tubo de ensaio com uma concentração inicial de substrato de 50 micromolar (uM) fosse 80 µM /s, as inversas seriam 1/50 µM para a concentração de substrato e 1/80 µM /s para a concentração inicial. velocidade. Nota: a concentração inversa do substrato deve estar no eixo horizontal, e a velocidade inicial inversa deve estar no eixo vertical.

Nota: a concentração do substrato deve estar no eixo horizontal, e a velocidade inicial da reação deve estar no eixo vertical.

Determine a linha de regressão linear para o gráfico que você plotou na Seção 2, Etapa 1. Nota: porque você precisará saber a intersecção y para a linha de regressão, você deve inserir os pontos da Seção 2, Etapa 1 no Excel ou em uma calculadora gráfica e use a funcionalidade de modelagem de regressão integrada.

Divida 1 pela intersecção y a partir da linha de regressão linear. Isso lhe dará o valor do inverso do Vmax, a velocidade máxima de reação da enzima. Nota: se o modelo de regressão linear assumir a forma "[VO inverso] = m [Concentrado de substrato inverso] + b", então o valor de "b" seria a intersecção y. Divida 1 por "b" para calcular o inverso de Vmax.

Divida 1 pelo resultado da Seção 2, Etapa 3 para calcular o valor real de Vmax.

Determine a concentração da enzima no ensaio original (veja os dados brutos). Nota: a concentração de enzima é a mesma para todos os tubos de ensaio; somente as concentrações de substrato variam no ensaio.

Divida a Vmax (da seção 2, etapa 4) pela concentração da enzima (da seção 2, etapa 5). O resultado é o valor de Kcat.