Pesquisadores capturam imagens de alta resolução de íons de magnésio interagindo com a enzima de edição de genes CRISPR
AceCas9 e sua dependência metálica. um , Topo:organização de domínio de AceCas9 mostrada como blocos coloridos na direção do terminal N para o terminal C. As regiões correspondentes aos domínios estruturais são coloridas e rotuladas, e os resíduos relevantes são rotulados. RuvC-I – RuvC-III, segmentos descontínuos do domínio RuvC; BH, ponte hélice; REC1, domínio 1 de reconhecimento de ácido nucleico; REC2, domínio 2 de reconhecimento de ácido nucleico; HNH, domínio de nuclease HNH; PID, domínio de interação PAM. Parte inferior:diagrama esquemático dos ácidos nucléicos utilizados neste estudo, mostrados como nucleotídeos nas estruturas secundárias previstas. Os locais de clivagem para o DNA NTS pelo domínio RuvC e o DNA TS pelo domínio HNH são indicados pelos triângulos descendentes verdes e roxos, respectivamente. O PAM e a região guia são destacados em cinza. Os TS e NTS são numerados sequencialmente com os números NTS indicados com asteriscos. b , Sobreposição dos perfis de filtração em gel da proteína AceCas9 e seu complexo de ribonucleoproteína (RNP) montado com o sgRNA mostrado em a . As amostras coletadas para análise bioquímica e crio-EM são destacadas pela área sombreada em cinza. c , Resultados de clivagem de DNA de fita dupla (dsDNA) montado com DNA de TS marcado com hexaclorofluoresceína (HEX) (vermelho) ou o oligonucleotídeo NTS marcado com amiditos de fluoresceína (FAM) (verde) a 10 nM por AceCas9 ou seus mutantes catalíticos a 1 μM na presença de vários íons divalentes a 10 mM. WT, AceCas9 de tipo selvagem; U, substrato de DNA não clivado; Substrato de DNA clivado C; dHNH, AceCas9 com HNH desativado; dRuvC, AceCas9 com RuvC desativado. Crédito:Nature Catalysis (2023). DOI:10.1038/s41929-023-01031-1 A tecnologia de edição genética conhecida como CRISPR levou a mudanças revolucionárias na agricultura, na investigação em saúde e muito mais.
Em pesquisa publicada na Nature Catalysis , cientistas da Florida State University produziram as primeiras imagens de alta resolução com lapso de tempo mostrando íons de magnésio interagindo com a enzima CRISPR-Cas9 enquanto ela corta fitas de DNA, fornecendo evidências claras de que o magnésio desempenha um papel tanto na quebra de ligações químicas quanto na quase-quebra. corte simultâneo de DNA.
"Se você está cortando genes, você não quer que apenas uma fita de DNA seja quebrada, porque a célula pode repará-la facilmente sem edição. Você quer que ambas as fitas sejam quebradas", disse Hong Li, professor do Departamento de Química. e Bioquímica e diretor do Instituto de Biofísica Molecular. "Você precisa de dois cortes próximos. O magnésio desempenha um papel nisso e vimos exatamente como isso funciona."
CRISPR-Cas9 é a ferramenta mais utilizada para manipulação genética. A tecnologia usa uma enzima reaproveitada para se ligar ao DNA, permitindo alterações em locais específicos do genoma.
Os cientistas sabiam que o magnésio desempenha um papel neste processo, mas não estava claro exatamente como, e ninguém foi capaz de capturar imagens de perto do processo em lapso de tempo. Ao aproveitar uma versão mais lenta do CRISPR-Cas9, esta pesquisa mostrou que os íons de magnésio no centro da reação de catálise são a chave para o corte quase simultâneo.
“Acho que muitas vezes na ciência, mesmo que você possa inferir algo, você gostaria de ter uma prova”, disse Li. "Por exemplo, com o magnésio, todo mundo sabe que você precisa dele, mas não vê-lo em ação não é ciência completa, certo? Você não tem o mesmo nível de compreensão de como ele funciona." Uma imagem da enzima CRISPR-Cas9 incorporada em gelo interagindo com íons de magnésio capturada pelo microscópio crioeletrônico no Biological Science Imaging Resource da FSU. A imagem está na escala de nanômetros, que equivale a um bilionésimo de metro. Crédito:Faculdade de Artes e Ciências Hong Li/FSU Os pesquisadores usaram o microscópio crioeletrônico do Biological Science Imaging Resource da FSU, que pode produzir imagens com resolução quase atômica, para observar íons metálicos e outros átomos trabalhando dentro da enzima CRISPR-Cas9. Isso permitiu-lhes recolher dados que não só confirmaram as suas hipóteses anteriores, mas também levaram à surpreendente descoberta sobre como o magnésio coordena as quebras da cadeia dupla.
O CRISPR fez a sua estreia na edição genética em 2013 e, desde então, os cientistas têm trabalhado para aumentar a sua fiabilidade e expandir a sua aplicabilidade a uma variedade de diversos organismos e tipos de células.
"Ao alterar os sítios ativos - os conjuntos de 'tesouras' que cortam fitas de DNA alvo e não-alvo - podemos influenciar a capacidade do Cas9 de usar metais alternativos para corte", disse o doutorando e coautor do artigo Mitchell Roth. “Ainda há muito a explorar com o CRISPR.”
Compreender como cada elemento afeta o funcionamento da enzima dá aos cientistas uma visão sobre quais caminhos de pesquisa podem gerar novos conhecimentos e utilizações. Li e sua equipe estão planejando mais pesquisas para investigar como o CRISPR-Cas9 pode ser reequipado para outros fins.
Os coautores deste artigo foram os ex-pesquisadores de pós-doutorado Anuska Das e Jay Rai, o candidato ao doutorado Yuerong Shu, a estudante de graduação Megan L. Medina e o ex-aluno de graduação Mackenzie R. Barakat, todos da FSU.
Mais informações: Anuska Das et al, Estados catalíticos acoplados e o papel da coordenação metálica em Cas9, Nature Catalysis (2023). DOI:10.1038/s41929-023-01031-1 Informações do diário: Catálise da Natureza
