As investigações e manipulações ópticas freqüentemente formam o núcleo dos experimentos biológicos. Em um novo relatório agora publicado em Avanços da Ciência , Kazuki Okamato e uma equipe de cientistas em ciências farmacêuticas, neurociência, Medicina, física e inteligência artificial na Universidade de Tóquio, Japão, introduziu um novo material de vidro de borosilicato contendo um térbio de íon de terras raras (III) (Tb ³⁺ ) O material emitiu fluorescência verde após excitação de luz azul, muito parecido com a proteína fluorescente verde (GFP) com ampla compatibilidade em ambientes de pesquisa biológica. Usando micropipetas feitas de vidro dopado com térbio, Okamato et al. células marcadas com GFP direcionadas para eletroporação de célula única, análise de transcriptoma de célula única e experimentos de gravação patch-clamp sob controle microscópico de fluorescência em tempo real. O vidro também mostrou potencial de geração de terceiro harmônico mediante excitação de laser infravermelho, útil para direcionamento óptico online de neurônios marcados com fluorescência no neocórtex in vivo. Desta maneira, o vidro dopado com térbio simplificou procedimentos múltiplos em experimentos biológicos com aplicações mais amplas na pesquisa biomédica.

Conduzindo investigações ópticas in vivo

Investigações ópticas e manipulações de células em tecidos vivos são amplamente difundidas na pesquisa biológica, com capacidade de revelar diversas propriedades nas células e durante a comunicação intracelular. Embora a marcação genética tenha permitido a identificação de células que expressam proteínas fluorescentes, continua difícil acessar células marcadas com fluorescência usando pipetas de vidro, uma vez que o vidro não é fluorescente na faixa visível. Para resolver esses problemas técnicos, Okamato et al. introduziu uma nova composição de vidro de borosilicato. Os íons de terras raras exibiram emissão de fluorescência única com picos agudos no espectro de luz visível. A equipe se concentrou em térbio (III) (Tb ³⁺ ), que têm estruturas de nível de energia complexas e teoricamente espera-se que emitam fluorescência verde. O comprimento de onda de excitação estava próximo da visibilidade mais alta para os olhos humanos e próximo ao da proteína fluorescente verde. Como resultado, pipetas feitas de vidros dopados com térbio foram úteis para direcionamento de fluorescência, manipulação de uma única célula nas ciências da vida.

A equipe desenvolveu o vidro de borosilicato usando 3,1 por cento molar (mol%) de óxido de térbio (Tb ₂ O ₃ ) O térbio (Tb ³⁺ ) - o vidro dopado emitiu fluorescência verde visível a olho nu, mesmo sob a luz do quarto. The Tb ³⁺ -vidro dopado teve um pico de absorção em um comprimento de onda de 484 nm, o que não foi observado em vidro de borosilicato normal sem térbio. Os cientistas produziram capilares de vidro e pipetas onde o vidro moldado continuou a emitir fluorescência verde. Usando microscopia eletrônica de varredura, a equipe verificou as pontas da pipeta em busca de quaisquer aberrações que pudessem afetar a qualidade dos registros eletrofisiológicos. Okamato et al. em seguida, usou as novas micropipetas para conduzir a eletroporação de uma única célula de uma proteína fluorescente vermelha (tdTomato) em neurônios em estruturas de fatias hipocampais organotípicas de ratos. Eles viram as pipetas contendo o vetor de corante vermelho e células piramidais que foram minimamente marcadas com GFP aprimorado, usando o mesmo aparelho óptico. Os cientistas colocaram as pontas das pipetas nas células e aplicaram pulsos elétricos para eletroporação para facilitar a expressão do corante vermelho após 48 horas. Depois disso, a equipe realizou o sequenciamento de RNA de uma única célula com as pipetas em fatias agudas do córtex motor primário de camundongos transgênicos.

Usando as novas micropipetas para gravações de patch clamp in vitro

Em seguida, os pesquisadores realizaram gravações de patch-clamp de culturas primárias de neurônios do hipocampo que foram esparsamente marcados com GFP usando uma pipeta dopada com térbio carregada com um corante fluorescente vermelho (Alexa Fluor 594). As pipetas preencheram com sucesso as células-alvo com o corante e as mantiveram na configuração de célula inteira. A equipe aplicou o mesmo método para preparações de fatias cerebrais agudas, onde os neurônios estavam localizados mais profundamente em tecidos menos transparentes do que os neurônios em cultura. Quando Okamato et al. células piramidais corrigidas nas fatias agudas do hipocampo usando pipetas dopadas com térbio, os neurônios mostraram potenciais de ação normais em resposta a breves injeções atuais. As células exibiram correntes pós-sinápticas excitatórias e inibitórias espontâneas normais sob a configuração de pinça de voltagem. As micropipetas podiam ser usadas para gravações estáveis ​​de longo prazo e também eram úteis para gravações de neurites. A equipe registrou os potenciais de ação backpropagating usando a configuração de dendritos direcionados.

Gravações de patch-clamp in vivo usando pipetas dopadas com térbio

Okamato et al. next characterized the nonlinear multiphoton excitation of terbium-doped glass using infrared light at wavelengths that were approximately double the single-photon excitation peak (484 nm) of terbium. Using a photomultiplier tube through a 495-to-540 nm band-pass filter, the team captured the green fluorescence emitted by terbium-doped pipettes. The emissions peaked at an excitation wavelength of 975 nm, suggesting that a laser wavelength corresponding to the value excited the glass through a two-photon absorption process. The scientists also noted another bright signal at 1300 nm excitation through a 410-to-450 band pass filter and suggested the signal to have likely arisen from third harmonic generation (THG). Based on the strong THG signal of the micropipettes, Okamato et al. conducted in vivo whole cell patch-clamp recordings with a multiphoton laser microscope. They simultaneously used the cells and terbium-doped pipette using dual-laser irradiation at 1, 040 nm and 1, 300 nm, respectivamente, and recorded the injection-induced action potentials and spontaneous membrane fluctuations under the current-clamp configuration.

Desta maneira, Kazuki Okamato and colleagues invented a terbium-doped glass emitting green fluorescence signal strong enough to be visible to the naked eye. The material had similar characteristics to conventional borosilicate glass and did not display photobleaching or cytotoxicity. The new micropipettes allowed fluorescence manipulations such as optical targeting of single-cell electroporation, single-cell RNA sequencing and electrophysiological recordings. The glass also emitted third harmonic generation upon three-photon excitation, applicable for in vivo manipulation. The terbium-doped glass therefore provided a platform for multiple purposes in biomedical research including hitherto conventional patch-clamp recordings to open new frontiers in life sciences.

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