p Uma equipe da Cidade do Cabo publicou recentemente o primeiro artigo de alta resolução sobre microscopia crioeletrônica (EM) originário da África. Conforme descrito em Nature Communications Biology , a equipe resolveu a estrutura de uma enzima nitrilases para uma resolução quase atômica e usou os insights estruturais para projetar uma enzima mutante que poderia ser ajustada para aplicações em biotecnologia. Este trabalho foi possível através de um programa de acesso financiado pelo projeto Synchrotron Techniques for African Research and Technology, uma bolsa colaborativa que visa construir parcerias entre cientistas líderes mundiais na África e no Reino Unido trabalhando juntos em pesquisas usando ciência síncrotron. p As nitrilases são uma classe fascinante de enzimas vegetais que desempenham um papel significativo na síntese de uma ampla gama de produtos químicos importantes. Essas enzimas normalmente têm especificidade para uma pequena variedade de substratos, no entanto, eles têm um enorme potencial biotecnológico. Uma equipe de cientistas da Universidade da Cidade do Cabo começou a realizar esse potencial investigando a estrutura das enzimas usando crio-EM no Centro de Bioimagem de elétrons (eBIC).

p Depois de conseguir obter informações estruturais de alta qualidade, a equipe obteve uma imagem de resolução quase atômica (3,4 Å) de uma nitrilase derivada da família do repolho. Usando esta estrutura, a equipe projetou semirracionalmente uma nova nitrilase mutante que agia em substratos não catalisados ​​por nenhuma outra nitrilase natural.

p A equipe espera que eles possam progredir para fazer nitrilases 'projetadas' para qualquer substrato necessário para a indústria - sejam produtos farmacêuticos, produtos químicos finos ou mesmo alimentos. Mais trabalho no eBIC está planejado para continuar este estudo frutífero.

p Torções helicoidais

p As nitrilases são uma classe de enzimas usadas para produzir ácidos carboxílicos, amônia e amidas para a síntese em grande escala de medicamentos e produtos químicos industrialmente importantes. Uma equipe de cientistas da Universidade da Cidade do Cabo ficou fascinada por essas enzimas e queria estudar como elas evoluíram e correlacionam sua estrutura e função.

p O grupo inicialmente comparou duas nitrilases diferentes de Arabidopsis thaliana (um membro da família do repolho) e viu que um tinha uma ampla gama de substratos, mas o outro era muito mais específico para apenas um pequeno número de substratos. Eles realizaram uma série de mutações na bolsa de ligação das enzimas e descobriram que a troca de um único aminoácido alterava a preferência de substrato das nitrilases. Com este conhecimento tentador, o grupo decidiu obter informações estruturais detalhadas para revelar como as nitrilases selecionam seus substratos.

p Dr. Jeremy Woodward, Professor de Bioquímica Médica na Universidade da Cidade do Cabo e principal investigador do estudo explicou as motivações de seu grupo,

p "Para tentar descobrir o que estava acontecendo, imaginamos todas as enzimas usando crio-EM de baixa resolução na Universidade da Cidade do Cabo e descobrimos que elas formaram filamentos, e que o aperto de sua torção helicoidal foi correlacionado com o tamanho do substrato. Na verdade, o aminoácido que descobrimos estava localizado em uma interface entre duas subunidades helicoidais. Observamos essa correlação com um grande número de enzimas nitrilase, mas não conseguia explicar o que estava acontecendo no nível molecular até nossa recente visita ao eBIC na Diamond Light Source. "

p Estrutura quase atômica

p A equipe havia usado anteriormente microscopia eletrônica de coloração negativa (EM), que é limitada a uma resolução de 20 Å, e não é alto o suficiente para ver detalhes atômicos na estrutura. Adicionalmente, trabalhos anteriores de outros laboratórios mostraram que as nitrilases não podem ser cristalizadas, então crio-EM era sua única opção.

p "Este era o único método que poderia ser usado para responder às perguntas que eles tinham, "explicou a Dra. Adriana Klyszejko, associado de pesquisa de pós-doutorado no eBIC que ajudou no estudo. "Na Diamond, o que criamos é um esforço integrado para nossa comunidade de usuários, onde eles podem levar suas pesquisas adiante. "

p No eBIC, a equipe obteve uma estrutura com resolução de 3,4 Å. Dr. Woodward, elaborado:

p "A alta qualidade dos dados que obtivemos nos permitiu visualizar a estrutura de um filamento helicoidal de nitrilase intacto em resolução próxima à atômica pela primeira vez. Observamos um loop, mantida na posição pelo aminoácido que descobrimos, que limita o tamanho máximo dos substratos ligados e muda com a torção helicoidal. "

p A concessão START

p O trabalho foi possível com uma bolsa de Técnicas Síncrotron para Pesquisa e Tecnologia Africana (START); uma iniciativa criada em março de 2019 para construir parcerias entre cientistas na África e no Reino Unido. O START é financiado por uma doação de £ 3,7 milhões do Conselho de Instalações de Ciência e Tecnologia do UKRI (STFC) do Fundo de Pesquisa de Desafios Globais (GCRF). O STFC concedeu financiamento do GCRF, um fundo de £ 1,5 bilhões de 5 anos que é um componente-chave na execução da Estratégia de Ajuda do Reino Unido, garantindo que a pesquisa do Reino Unido assuma um papel de liderança na abordagem dos problemas enfrentados pelos países em desenvolvimento por meio da pesquisa e da inovação.

p A motivação para o START vem dos desafios sociais enfrentados pelas comunidades africanas; por exemplo, 600 milhões de pessoas (70%) na África Subsaariana vivem sem eletricidade, e um fornecimento confiável de eletricidade é uma das ferramentas mais poderosas para tirar as pessoas da pobreza e acabar com sua dependência de ajuda. Os pesquisadores do START investigarão os materiais energéticos, incluindo estruturas de células solares, catalisadores e baterias. O desenvolvimento da saúde na África é dificultado pela falta de compreensão fundamental da causa em doenças como a malária ou o HIV. A biologia estrutural oferece uma visão sem precedentes dos mecanismos por trás dessas doenças.

p Além de fornecer acesso às instalações de classe mundial do eBIC para os cientistas da África do Sul, a bolsa também apoiou um cientista pós-doutorado, Dr. Andani Mulelu, que foi o investigador principal do estudo. "Este trabalho não teria sido possível sem isso, porque o equipamento, o suporte e a infraestrutura necessários para conduzir com sucesso este experimento não estão disponíveis na África, "explicou o Dr. Woodward.

p Dr. Gwyndaf Evans, Cientista principal da linha de luz na linha de luz VMXm da Diamond, e Pesquisador Principal em Ciências da Vida para os comentários do projeto START:

p "A iniciativa START visa, entre outras coisas, para ajudar a construir experiência e capacidade para biologia estrutural na África. Inicialmente, estamos colocando ênfase na facilitação do acesso às instalações de biologia estrutural da Diamond por meio de cursos de treinamento focados na África do Sul e localmente aqui na Diamond. O objetivo final é demonstrar aos órgãos de financiamento africanos o poder e os benefícios da biologia estrutural na abordagem dos problemas africanos na saúde humana e na agricultura para tornar a biologia estrutural uma atividade sustentável no continente. Ver especialistas como Jeremy Woodward alcançar uma posição estável na África do Sul é um bom presságio para o futuro e contribui para a construção dessa sustentabilidade. "

p Nitrilases de designer

p Usando os insights obtidos com a estrutura crio-EM de alta resolução, a equipe analisou mais de 5, 000 mutantes para projetar uma nova enzima com uma torção helicoidal alterada que atue em um novo conjunto de substratos não catalisados ​​por nenhuma outra nitrilase vegetal. Isso foi realizado identificando aminoácidos 'hotspot' para evolução dirigida e selecionando-os por meio do acoplamento da sobrevivência das bactérias à conversão bem-sucedida de uma biblioteca de substratos.

p Com base neste trabalho, a equipe espera fazer o ajuste fino das nitrilases para realizar todo o seu potencial biotecnológico. "Gostaríamos de chegar ao ponto em que podemos produzir nitrilases 'projetadas' para qualquer substrato, fazendo as alterações adequadas na torção helicoidal, bem como no bolso de ligação. Para conseguir isso, gostaríamos de visualizar uma coleção de nitrilases chave com uma gama de diferentes estados helicoidais (e especificidades de substrato) por crio-EM de alta resolução, "concluiu o professor Woodward.