Um dos principais desafios da produção de biocombustíveis de segunda geração é identificar enzimas produzidas por microrganismos para uso em um coquetel de enzimas para catalisar a hidrólise de biomassa em que as enzimas atuam juntas para quebrar os carboidratos da palha da cana e do bagaço, por exemplo, e convertê-los em açúcares simples para fermentação.

Um grupo de pesquisadores da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), trabalhando em parceria com colegas do Laboratório Nacional de Biorrenováveis ​​(LNBR) em Campinas, Estado de São Paulo, Brasil, descobri que Trichoderma harzianum , um fungo encontrado na Amazônia, produz uma enzima com potencial para desempenhar um papel fundamental em coquetéis de enzimas.

A enzima, que é chamada de β-glucosidase e pertence à família 1 da glicosídeo hidrolase (GH1), atua na última etapa da degradação da biomassa para produzir glicose livre para fermentação e conversão em etanol. No laboratório, Contudo, os pesquisadores observaram que altos níveis de glicose inibiram a atividade da β-glicosidase.

"Também descobrimos que a atividade catalítica ideal da enzima ocorreu a 40 ° C. Isso representou outro obstáculo para o uso da enzima porque, em um ambiente industrial, a hidrólise enzimática da biomassa é realizada em temperaturas mais altas, normalmente em torno de 50 ° C, "disse Clelton Aparecido dos Santos, Pós-doutorado no Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética (CBMEG) da UNICAMP com bolsa da FAPESP.

Com base na análise da estrutura da enzima combinada com técnicas de genômica e biologia molecular, os pesquisadores foram capazes de modificar a estrutura para resolver esses problemas e aumentar consideravelmente sua eficiência de degradação de biomassa.

O estudo resultou de um projeto com bolsa regular de pesquisa da FAPESP e de um Projeto Temático também apoiado pela FAPESP. Os resultados são publicados na revista Relatórios Científicos .

"A proteína modificada que desenvolvemos se mostrou muito mais eficiente do que a enzima não modificada e pode ser usada para complementar os coquetéis de enzimas vendidos hoje para quebrar a biomassa e produzir biocombustíveis de segunda geração, "Santos contou.

Para chegar à proteína modificada, os pesquisadores inicialmente compararam a estrutura cristalina da molécula original com estruturas de outras β-glucosidases de tipo selvagem nas famílias de glicosídeos hidrolases GH1 e GH3. Os resultados da análise mostraram que as glicosidases GH1 tolerantes à glicose tinham um canal de substrato mais profundo e estreito do que outras β-glicosidases e que esse canal restringia o acesso da glicose ao sítio ativo da enzima.

Β-glicosidases menos tolerantes à glicose tinham um canal de entrada do local ativo mais raso, mas mais amplo, permitindo que mais da glicose produzida por essas enzimas entre no último estágio da degradação da biomassa. A glicose retida bloqueia o canal da proteína e reduz sua atividade catalítica.

Com base nesta observação, os pesquisadores usaram uma técnica de biologia molecular conhecida como mutagênese dirigida ao local para substituir dois aminoácidos que podem estar atuando como "porteiros" na entrada do sítio ativo da enzima, deixando a glicose entrar ou bloqueando-a. A análise de seus experimentos mostrou que a modificação estreitou o canal para o site ativo.

"O sítio ativo da enzima mutante encolheu para um tamanho semelhante ao das GH1 β-glicosidases tolerantes à glicose, "Disse Santos.

Eficiência aprimorada

Os pesquisadores realizaram uma série de experimentos para medir o desempenho aprimorado da proteína na quebra de biomassa, especialmente bagaço de cana, um resíduo agroindustrial com grande potencial de aproveitamento lucrativo no Brasil. Durante estágio de pesquisa no exterior com bolsa da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo - FAPESP, Santos trabalhou com um grupo de pesquisa liderado por Paul Dupree, professor da Universidade de Cambridge, no Reino Unido, em uma análise da eficiência de liberação de glicose da enzima adaptada quando diferentes fontes de biomassa vegetal foram convertidas.

A análise mostrou que a eficiência catalítica da enzima modificada foi 300% maior do que a da enzima do tipo selvagem em termos de liberação de glicose. Além disso, era mais tolerante à glicose, então, mais glicose foi liberada de todas as matérias-primas de biomassa testadas. A mutação também aumentou a estabilidade térmica da enzima durante a fermentação.

"A mutação dos dois aminoácidos no sítio ativo tornou a enzima supereficiente. Está pronta para aplicação industrial, "disse Anete Pereira de Souza, professora da UNICAMP e pesquisadora principal do projeto. "Uma das vantagens da enzima é que ela é produzida in vitro e não a partir de um fungo ou outro organismo modificado, portanto, pode ser produzido em massa a um custo relativamente baixo. "