Foram mais de 10 anos em construção, mas quando se tratava de descobrir os segredos da estrutura molecular das enzimas, perseverança valeu a pena. Ao estudar e comparar as enzimas que degradam a celulose de dois fungos, pesquisadores do Laboratório Nacional de Energia Renovável (NREL) do Departamento de Energia identificaram regiões nessas enzimas que podem ser direcionadas por meio de engenharia genética para ajudar a quebrar a celulose mais rapidamente.

Recentemente publicado em Nature Communications , "Atividade de celobiohidrolase aprimorada por engenharia" descreve o estudo de longa duração do NREL das celobiohidrolases fúngicas (CBHs) - enzimas que usam a hidrólise como sua principal química para degradar a celulose - Trichoderma reesei (TrCel7A) e Penicillium funiculosum (PfCel7A). Anos de pesquisa meticulosa renderam grandes recompensas:a equipe ganhou uma melhor compreensão das relações estrutura-atividade dessas enzimas para prever os melhores lugares para fazer mudanças e melhorias.

Tanto na natureza quanto nos processos industriais, as enzimas desta família estão entre as enzimas mais importantes para quebrar a celulose. Um projetado 2, Usina de etanol celulósico de 000 toneladas por dia poderia usar potencialmente até 5, 000 toneladas de enzima por ano, e metade desse coquetel de enzimas pode ser desta família de enzimas. "Nas últimas décadas, tem havido um esforço para tentar entender e melhorar os biocatalisadores desta família de enzimas chave, "disse Gregg Beckham, líder do grupo no NREL e autor sênior do estudo. "Quanto mais eficiente a enzima, quanto menos enzima usada, e, portanto, o processo é mais barato. Contudo, ainda temos um longo caminho a percorrer para podermos fazer melhorias na capacidade preditiva. "

Então, em 2005, Pesquisadores do NREL Mike Himmel, Steve Decker, e Bill Adney descobriu um CBH de um fungo diferente, PfCel7A, e descobriu que tem um desempenho 60% melhor do que o TrCel7A. "Surpreendeu-nos que esta enzima fosse muito melhor do que o padrão da indústria, "disse Decker, que liderou a tarefa depois que Adney deixou o NREL. "Fizemos muitos experimentos nos últimos anos para ter certeza de que a atividade era real. Então, claro, queríamos saber por que era melhor. "

“Se pudéssemos entender as diferenças estruturais, então poderíamos potencialmente usar essas informações para criar enzimas melhores, o que, por sua vez, poderia ajudar a reduzir o custo do biocombustível celulósico e da produção bioquímica, "disse Beckham." Dado o desafio de trabalhar com essas enzimas, a equipe do NREL levou sete anos de trabalho experimental exaustivo para desenvolver as ferramentas necessárias para verificar se há alguns pontos quentes nesses dois CBHs que podem ser modificados para que tenham um desempenho melhor. "

De acordo com Decker, "No momento, ferramentas para engenharia genética em Trichoderma eram muito limitadas, mas sabíamos de trabalhos anteriores que outros hospedeiros tinham problemas para expressar essas proteínas. Basicamente, começamos do zero e construímos nosso próprio sistema interno de cepas hospedeiras de T. reesei, vetores, e protocolos de transformação e triagem. Em comparação com sistemas bem desenvolvidos como E. coli, A baixa eficiência de transformação do T. reesei, processos de seleção tediosos, Crescimento lento, e o baixo rendimento de proteína tornou esta operação um desafio. Cada cepa que construímos levou meses, desde o projeto até o teste final. "

A descoberta se desdobrou quando o NREL examinou de perto as semelhanças entre TrCel7A e PfCel7A e depois trabalhou para isolar as diferenças. Ambas as enzimas têm uma arquitetura de três domínios:a molécula de ligação ao carboidrato que o liga à celulose; o domínio catalítico que decompõe a celulose; e o link que conecta esses dois domínios. A equipe de pesquisa conduziu experimentos de troca de domínio criando uma biblioteca quimera, que é uma coleção de enzimas mutantes criadas a partir das duas enzimas parentais.

"Com três domínios entre dois pais, isso perfaz oito combinações no total, "disse Beckham." Testamos as várias combinações para descobrir qual área está fornecendo a enzima com melhor desempenho, e talvez não surpreendentemente, em retrospectiva, é o domínio catalítico. "

Com essas descobertas, os pesquisadores então compararam os domínios catalíticos de TrCel7A e PfCel7A e encontraram oito áreas que eram diferentes. Continuando a diminuir as possibilidades, a equipe pegou o pai TrCel7A e fez modificações, um por vez, nessas oito áreas e descobriu duas modificações importantes que resultaram no desempenho de TrCel7A quase ao nível do pai PfCel7A.

"Aqueles dois, mudanças muito pequenas nesta enorme proteína basicamente dobraram o desempenho de TrCel7A, "disse Beckham." O que isso ensina aos pesquisadores que fazem engenharia de proteínas nessas enzimas incrivelmente desafiadoras é que há mudanças muito pequenas neste domínio catalítico que podem ser modificadas para afetar drasticamente o desempenho da enzima, tornando-o capaz de quebrar a celulose mais rapidamente e, assim, permitindo que os processos industriais usem menos enzimas. "

“Sabíamos que a descoberta do PfCel7A era importante na época, mas o caminho a seguir não era totalmente claro, "disse Himmel, o líder geral do projeto. "Lidamos primeiro com a família de celulases mais difícil de melhorar, e assim se segue que as enzimas que degradam a biomassa de outras famílias podem ser tornadas ativas ao máximo em um processo mais simplificado, com menos pesquisa e desenvolvimento. Foi a fusão de bioquímica experimental e ciência computacional que trouxe este estudo para Nature Communications e esse resultado só foi possível com financiamento sustentado do Escritório de Tecnologias de Bioenergia. "

O objetivo final da equipe do NREL é ajudar outros pesquisadores a vasculhar a montanha de dados genômicos para encontrar enzimas melhores, com base apenas em sua sequência genética. "Em 10 anos, seria tão emocionante poder sentar-se com milhares de sequências de enzimas desta família e ser capaz de prever quais delas tentar, "disse Beckham." Este estudo é um passo em uma longa estrada, mas é um objetivo que vale a pena. "