Pesquisadores do Instituto Max Planck para a Ciência da Luz em Erlangen desenvolveram uma técnica para observar diretamente como as enzimas e outras biomoléculas realizam seu trabalho, com benefícios médicos e científicos potencialmente significativos. Usando esta técnica, Eles têm, pela primeira vez apenas com luz e sem um marcador, observaram mudanças conformacionais na DNA polimerase, a enzima responsável pela replicação do DNA. Como a técnica também pode ser usada para estudar como as enzimas realizam seu trabalho, poderia ajudar a identificar novos mecanismos para o desenvolvimento de medicamentos.

Quando os biólogos olham através de um microscópio moderno, o que eles veem é um pouco parecido com o que você veria se olhasse ao longo de uma rodovia à noite:os veículos são visíveis apenas pelos faróis e é impossível dizer se os faróis pertencem a um carro ou caminhão, ou se um carro estacionado está abrindo a porta. Atualmente, os biólogos só podem observar as enzimas realizando seu trabalho indiretamente. Eles anexam corantes fluorescentes a componentes individuais de biomoléculas e então observam os pontos de luz se movendo sob um microscópio. Eles podem ver muito pouco como a forma da enzima está mudando. Além disso, ter uma molécula de tinta ligada a ele significa que a enzima que eles estão observando não está em seu estado natural. Não se pode descartar que tais moléculas de corante possam afetar a função da enzima.

Uma equipe de pesquisadores liderada por Frank Vollmer, até recentemente, o líder de um Grupo de Pesquisa no Instituto Max Planck para a Ciência da Luz e agora um professor da Universidade de Exeter, tem, Contudo, desenvolveu uma técnica que lhes permite observar enzimas sem anexar um marcador fluorescente.

Um nanorod concentra a luz em uma área de apenas alguns nanômetros

Seu instrumento microscopicamente pequeno é efetivamente um sensor em um sensor. Um nanobastão de ouro com cerca de 10 nanômetros de diâmetro e 40 nanômetros de comprimento está preso a uma microesfera de vidro com um diâmetro de cerca de 80 micrômetros (1 micrômetro =1/1000 milímetro). Uma onda de luz, produzido por um laser, é enviado deslizando ao redor da borda interna desta microbead. Como essa onda se sobrepõe ligeiramente à borda da microesfera, ele interage com o nanorod anexado.

Essa interação começa bastante fraca, mas o microbead atua como uma galeria sussurrante:em uma rotunda, uma palavra sussurrada ao longo da parede pode ser ouvida claramente do outro lado, porque a onda sonora segue a curva da parede em vez de se dispersar em todas as direções. Do mesmo jeito, a onda de luz dando voltas e mais voltas dentro da microesfera passa pelo nanobastão de ouro milhares de vezes em um espaço de tempo extremamente curto, amplificando a interação com o nanorod.

O nanorod extrai a luz que se sobrepõe à borda da micropérola ainda mais. O resultado é uma área concentrada de luz, como um holofote, aproximadamente do mesmo tamanho da haste, ou seja, apenas alguns nanômetros de diâmetro. Se uma enzima ou outra molécula se liga ao nanobastão de ouro, é banhado por esse holofote. O sinal que o sensor produz depende da molécula posicionada no refletor e de como ela se move dentro dessa luz. Isso permite que os pesquisadores investiguem e registrem os movimentos de uma única molécula de enzima.

Sinais diferentes para conformações de enzimas diferentes

A técnica é baseada em um fenômeno conhecido como plasmônica. Aplicado a pequenas estruturas metálicas, como nanobastões, plasmonics permite que a luz seja concentrada em uma área de apenas alguns nanômetros. "Isso nos permite dimensionar a luz até o tamanho de uma enzima, "explica Frank Vollmer, do Instituto Max Planck para a Ciência da Luz em Erlangen. E ainda mais - os pesquisadores em Erlangen conseguiram até mesmo usar sua técnica para sondar íons individuais.

Em um experimento, os físicos anexaram a enzima DNA polimerase ao sensor e tentaram registrar como ela se move. A DNA polimerase se assemelha a uma mão segurando um cachimbo - o cachimbo, neste caso, sendo o filamento de DNA que está processando. Esta "mão" produz um sinal diferente quando está aberta e quando está fechada, pois isso muda o tamanho da sobreposição entre o ponto de luz e a enzima. Isso permitiu aos pesquisadores registrar como a enzima abre e fecha em tempo real. "O refinamento adicional de nossa técnica deve nos permitir fazer coisas como registrar diretamente a síntese de uma fita de DNA pela enzima polimerase, "explica Vollmer. Os bioquímicos seriam então capazes de observar em tempo real como a enzima copia a informação genética e até mesmo usar o sinal produzido pelo nanossensor para sequenciamento de DNA.

Experimentos usando a nova técnica foram capazes de observar mais do que apenas como as enzimas se movem. "Nós o usamos para observar a dependência da atividade enzimática com a temperatura, "explica Frank Vollmer. Isso oferece uma maneira fácil de realizar estudos termodinâmicos. Esses estudos podem fornecer informações sobre características como a energia de ativação de uma enzima, o físico explica. A energia de ativação é uma medida da eficiência desses catalisadores biológicos.

O nanossensor pode ser usado para observar reações químicas

Para demonstrar o quão pequenas podem ser as partículas que podem ser detectadas usando um nanossensor plasmônico, os pesquisadores usaram para observar íons individuais (átomos eletricamente carregados). "Ficamos surpresos que isso fosse possível, "diz Vollmer. Os íons de zinco e mercúrio que eles usaram têm apenas cerca de um décimo de nanômetro de tamanho - menos de um milésimo do comprimento de onda da luz usada. Contudo, possível produzir um ponto de luz no final de um nanorod que é capaz de sondar essas dimensões minúsculas. "Não se trata de identificar íons individuais, "enfatiza Vollmer. Os pesquisadores foram capazes de garantir que exatamente um íon se ligasse ao final do nanobastão variando a concentração de íons na solução. Baixar a essa escala poderia permitir aos biólogos estudar a função do canal iônico. Canais iônicos incluem, por exemplo, proteínas embutidas nas membranas das células nervosas que são responsáveis ​​pela transmissão do sinal ao longo do nervo.

O uso do nanossensor desenvolvido pela equipe de Frank Vollmer não se limita a visualizar processos bioquímicos envolvendo enzimas e outras proteínas. Também pode ser usado para observar reações químicas entre moléculas individuais e a superfície do nanobastão de ouro. "Usando esta técnica, nós podemos, por exemplo, detectar e analisar mecanismos de interação, "explica Frank Vollmer. O curso de tempo dessas interações pode fornecer insights sobre como diferentes moléculas se ligam à superfície do nanobastão de ouro.

Para demonstrar isso, os pesquisadores estudaram dois tipos de moléculas, um contendo um grupo amina, um contendo um grupo tiol. “Acontece que os dois grupos reagem com a superfície do ouro por meio de mecanismos diferentes, "explica Vollmer. Enquanto os grupos amina se ligam aos átomos de ouro que se projetam da superfície, os grupos tiol apenas se ligam a átomos completamente embutidos na superfície.

Os pesquisadores também observaram reações entre as várias moléculas. "Isso permite que os químicos testem e otimizem as condições de reação em tempo real, "diz Vollmer. O uso deste ponto de luz de nanobastão de ouro não se limita ao estudo de reações químicas, no entanto - também pode ser usado para controlá-los. Ao aumentar a intensidade da luz no ponto de luz concentrado, os pesquisadores permitiram que um íon de mercúrio se ligasse à superfície do nanobastão de ouro. A intensidade da luz no ponto de luz aumenta a energia dos elétrons na barra de ouro para que sejam capazes de reagir com os íons de mercúrio. Isso produz um amálgama estável de ouro e mercúrio. Os dois elementos permanecem amalgamados mesmo quando o ponto de luz desaparece, como a reação produz uma ligação covalente relativamente estável entre um átomo de ouro e um átomo de mercúrio.

"O controle das reações e da atividade enzimática no biossensor plasmônico é uma área muito interessante para pesquisas futuras, "diz Vollmer. O ponto de luz também pode ser usado como uma pinça óptica para fixar temporariamente biomoléculas únicas no sensor para análise óptica.

Insights sobre o mau funcionamento da máquina da vida

A visão futura da equipe de Vollmer é ser capaz de escanear moléculas - tanto biomoléculas quanto moléculas sintéticas - átomo por átomo. "Usando diferentes fontes de luz com diferentes comprimentos de onda e polarizações, é, em princípio, possível modificar o grau em que a luz se sobrepõe à molécula e sondar diferentes domínios da mesma molécula, "explica Vollmer. Um scanner molecular deste tipo pode ser capaz de observar um processo de uma variedade de ângulos diferentes e em intervalos muito curtos. Um mapa de alta resolução de tal processo aumentaria significativamente nossa compreensão da maquinaria molecular. Biólogos até mesmo ser capaz de observar em detalhes como essas estruturas mudam em períodos que variam de nanossegundos a várias horas. O biossensor plasmônico também levanta a possibilidade de um laboratório automatizado do tamanho de uma unha, que verifica uma amostra, proteína por proteína, para diagnosticar doenças a nível molecular.

Caso no futuro seja possível usar nanossensores plasmônicos para ver como as enzimas mudam de forma, isso pode permitir que os médicos entendam melhor como o mau funcionamento da máquina da vida causa doenças como o mal de Alzheimer, que estão associados a mudanças na estrutura da enzima. Uma melhor compreensão de tais processos pode até fornecer novas abordagens para o tratamento.