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Visão geral

O ADN de cadeia dupla é o modelo genético de todas as células vivas, mas os procedimentos para isolar ADN genómico de alta qualidade variam marcadamente entre tecidos animais e vegetais.

Fluxo de trabalho de extração geral

A lise celular começa com um detergente que rompe as membranas lipídicas, liberando a cromatina das membranas nucleares e das organelas. A mistura é então tratada com álcool para precipitar o DNA. Embora as etapas básicas sejam compartilhadas, a eficiência e a pureza do produto final dependem da arquitetura celular específica e da presença de contaminantes.

Estruturas celulares distintas

As células vegetais possuem uma parede celular rígida composta de celulose, hemicelulose e pectina e contêm cloroplastos que geram uma série de metabólitos secundários. Muitos genomas de plantas são poliplóides, aumentando a quantidade e a complexidade do DNA. As células animais não possuem parede celular e dependem de detergentes como o dodecil sulfato de sódio (SDS) para romper a membrana plasmática.

Desafios da extração de DNA vegetal

Romper a parede celular da planta é o primeiro obstáculo. A homogeneização mecânica ou digestão enzimática com celulase e pectinase remove a barreira. No entanto, polissacarídeos, compostos fenólicos e taninos podem coprecipitar com o DNA, reduzindo a pureza. Etapas de lavagem cuidadosas e o uso de tampões com alto teor de sal ajudam a mitigar essas impurezas.

Considerações sobre extração de DNA animal

Os leucócitos do sangue periférico são a fonte mais comum de DNA genômico animal. O sangue contém proteínas, lipídios e detritos celulares que podem ser coextraídos com o DNA. O contaminante primário é o heme, a parte não proteica da hemoglobina, que interfere nas reações enzimáticas posteriores. O uso de um tampão de lise de glóbulos vermelhos seguido de uma coluna de purificação ou extração com fenol-clorofórmio remove o heme e melhora o rendimento.

Propriedades comparativas do DNA

Os genomas das plantas são frequentemente maiores e mais complexos do que os genomas dos animais, em parte devido à duplicação de genes e a elementos repetitivos. Esta diferença de tamanho influencia a quantidade de material inicial necessária e a capacidade dos tampões de extração. Além disso, a presença de metabólitos secundários nas plantas pode alterar a composição dos pares de bases, afetando a amplificação por PCR e a qualidade do sequenciamento.

Dicas práticas para DNA de alta pureza

• Use RNase para eliminar a contaminação por RNA.
• Inclui uma etapa de protease para degradar proteínas residuais.
• Aplique uma coluna à base de sílica ou purificação por esfera magnética para obter resultados consistentes.
• Quantifique o DNA com um ensaio fluorométrico para evitar superestimação por espectrofotometria.

Ao adaptar o protocolo de extração ao tipo específico de célula, os pesquisadores podem obter DNA genômico confiável e de alta pureza, adequado para aplicações posteriores, como sequenciamento, PCR e clonagem.