Aqui está um colapso de como um gene humano é recombinado em um plasmídeo bacteriano, juntamente com as principais etapas envolvidas:

1. Obtendo o gene humano de interesse

* Isolamento do DNA humano: O gene humano desejado é extraído de células humanas usando técnicas como digestão da enzima de restrição ou PCR (reação em cadeia da polimerase).
* Síntese : O gene também pode ser sintetizado artificialmente, usando a tecnologia de síntese de genes, que geralmente é mais eficiente para genes complexos.

2. Preparando o vetor de plasmídeo

* Seleção de plasmídeo: Um vetor plasmídico adequado é escolhido, geralmente um com vários locais de clonagem (MCS), genes de resistência a antibióticos e outras características que facilitam a clonagem.
* Digestão da enzima de restrição: O plasmídeo é aberto em locais específicos usando enzimas de restrição, criando "extremidades pegajosas" que são compatíveis com o gene humano.

3. Ligação (união) do gene e plasmídeo

* Compatibilidade: As extremidades pegajosas do gene humano e o plasmídeo linearizado são projetadas para serem compatíveis, permitindo que se unam através do emparelhamento de bases complementar.
* enzima ligase: O DNA ligase é usado para catalisar a formação de ligações fosfodiestres, unindo permanentemente o gene humano no plasmídeo.

4. Transformação em bactérias

* células competentes: As células bacterianas são feitas "competentes" para assumir o DNA por vários métodos, como choque térmico ou eletroporação.
* Introdução: Os plasmídeos recombinantes são introduzidos nas bactérias competentes.
* Seleção: As bactérias que adotaram com sucesso o plasmídeo são selecionadas cultivando -as em mídia contendo antibióticos. Somente bactérias com o plasmídeo crescerão devido ao gene da resistência a antibióticos.

5. Verificação e confirmação

* colônia PCR: A PCR é usada para confirmar a presença do gene humano nas colônias bacterianas.
* sequenciamento: A sequência do gene inserida é verificada pelo sequenciamento de DNA para garantir que esteja correto e intacto.

componentes e considerações -chave:

* Enzimas de restrição: Essas enzimas cortam o DNA em sequências específicas, criando extremidades compatíveis para ligação.
* DNA ligase: Esta enzima se junta às pontas dos fios de DNA.
* Marcadores de resistência a antibióticos: Esses genes no plasmídeo permitem a seleção de bactérias que incorporaram com sucesso o plasmídeo.
* mcs (vários sites de clonagem): Essa região do plasmídeo contém vários locais de enzimas de restrição, permitindo a inserção de diferentes genes.

Por que isso é importante?

* Produção de proteínas: Bactérias recombinantes podem ser usadas para produzir grandes quantidades de proteínas humanas, como insulina ou hormônio do crescimento, para fins terapêuticos.
* Ferramentas de pesquisa: Os plasmídeos recombinantes são essenciais para a clonagem de genes e estudos de expressão gênica.
* Terapia gene: Em alguns casos, plasmídeos recombinantes contendo genes terapêuticos podem ser usados para fornecer genes corretivos às células na terapia gênica.

Nota: Os detalhes específicos do processo podem variar dependendo do gene que está sendo clonado, do host bacteriano e da aplicação desejada.