Aqui está um colapso de como isolar aminoácidos livres das proteínas, juntamente com as considerações importantes:
Métodos para isolar aminoácidos livres de proteínas 1.
hidrólise: *
Hidrólise ácida: O método mais comum. Ácidos fortes (como HCl) são usados para quebrar as ligações peptídicas na proteína, liberando os aminoácidos individuais.
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Procedimento: * A amostra de proteína é tratada com HCl concentrado (normalmente 6m) a altas temperaturas (100-110 ° C) por 12-24 horas.
* Esse processo cliva todas as ligações peptídicas, libertando aminoácidos livres.
* Após a hidrólise, o ácido é removido por evaporação, deixando a mistura de aminoácidos.
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Vantagens: Eficaz, relativamente simples.
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Desvantagens: Pode levar à degradação de aminoácidos, especialmente no triptofano. Alguns aminoácidos como a cisteína podem ser destruídos ou modificados.
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hidrólise enzimática: Utiliza enzimas específicas (como proteases) para quebrar proteínas em peptídeos e, finalmente, aminoácidos livres.
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Procedimento: * As enzimas específicas são selecionadas com base na estrutura da proteína e no resultado desejado.
* A incubação com a enzima em condições ideais permite a quebra controlada.
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Vantagens: Condições mais suaves, menos degradação, podem ser mais seletivas.
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Desvantagens: Pode ser mais caro, mais lento que a hidrólise ácida.
2.
Separação e purificação: * Cromatografia
: * Cromatografia em troca de íons: Separa os aminoácidos com base em sua carga.
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cromatografia de exclusão de tamanho: Separa os aminoácidos com base em seu tamanho.
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cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC): Método altamente sensível e preciso para separar e quantificar aminoácidos.
* Eletroforese: Separa os aminoácidos com base em sua carga e tamanho.
Considerações: *
Fonte da proteína: O tipo de proteína que você está começando influenciará o melhor método.
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Resultado desejado: Você está simplesmente procurando identificar a presença de aminoácidos livres ou precisa quantificá -los?
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Sensibilidade: O nível de sensibilidade necessário na análise.
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Custo e equipamento: Considere os recursos disponíveis.
Fluxo de trabalho geral: 1.
Preparação de proteínas: Isolar e purificar a proteína de interesse.
2.
hidrólise: Escolha o método de hidrólise apropriado (ácido ou enzimático).
3.
Separação e purificação: Selecione e otimize o método para separar e isolar os aminoácidos livres.
4.
Identificação e quantificação: Use técnicas como cromatografia, eletroforese ou outros métodos analíticos para identificar e quantificar os aminoácidos livres.
Nota importante: Os procedimentos e condições específicos para o isolamento de aminoácidos livres das proteínas variam dependendo da fonte de proteína, do resultado desejado e dos recursos disponíveis.
