Pesquisa melhora a mutagênese multiplex para aumentar a eficiência experimental na edição do genoma vegetal
Crédito:Unsplash/CC0 Domínio Público CRISPR/Cas9 continua sendo a ferramenta mais poderosa para gerar mutações em genomas de plantas. O estudo das várias combinações de mutações aumentou significativamente a escala das configurações experimentais, necessitando de mais espaço para cultivar numerosas plantas.
Pesquisadores do Centro VIB-UGent de Biologia de Sistemas Vegetais melhoraram a mutagênese multiplex, o que reduz a complexidade e o custo de projetos de edição de genoma em grande escala. Seus resultados foram publicados no The Plant Journal .
Os experimentos CRISPR/Cas estão aumentando continuamente em escala, não apenas em termos do número de mutantes criados através da edição precisa do genoma, mas também em termos do número de genes que podem sofrer mutação simultaneamente. O laboratório de Thomas Jacobs, do Centro VIB-UGent de Biologia de Sistemas Vegetais, desenvolveu telas para transformar sistematicamente dezenas, centenas ou até milhares de genes de cada vez.
O objetivo é aumentar a eficiência das mutações hereditárias da linhagem germinativa e, em última análise, reduzir a complexidade e o custo de projetos de edição genômica em larga escala.
Para conseguir isso, a equipe se concentrou em dois aspectos principais do design do vetor CRISPR/Cas9:o promotor para impulsionar a expressão de Cas9 e os sinais de localização nuclear (NLS) que direcionam a proteína para o núcleo. Ao genotipar milhares de plantas de Arabidopsis, eles descobriram que o uso do promotor RPS5A para expressar Cas9 levou à maior taxa de mutação, e que flanquear a proteína Cas9 com NLS bipartido era a configuração mais eficiente para criar mutações na linha germinativa.
A combinação desses dois elementos resulta na maior eficiência de edição multiplex observada, com 99% das plantas abrigando pelo menos uma mutação knockout e mais de 80% com 4 a 7 mutações.
"Isso representa um avanço significativo no campo da genética vegetal e fornece uma ferramenta confiável e eficiente para pesquisadores que se concentram em engenharia genética complexa. O que considero particularmente interessante é o efeito do NLS. Atrevo-me a dizer que teve um efeito mais forte do que o promover ", disse o Dr. Thomas Jacobs, líder do grupo VIB-UGent Center for Plant Systems Biology
As otimizações alcançadas no estudo reduzem significativamente a complexidade e o custo de projetos de edição de genoma em larga escala na ciência das plantas. Para colocar em números:com seu vetor anterior, estimou-se que uma triagem CRISPR procurando todos os nocautes duplos de apenas 20 genes exigiria uma população de cerca de 18.000 plantas. Com os novos vetores, serão necessárias cerca de 3 mil plantas.
“Essas otimizações serão úteis para gerar nocautes de ordem superior na linhagem germinativa de Arabidopsis e provavelmente também se aplicarão a outros sistemas CRISPR”, disse Ward Develtere, Ph.D. estudante e principal autor do relatório.
