A absorção de três fótons (3PA) é um processo óptico não linear que envolve a absorção simultânea de três fótons para excitar um elétron do estado fundamental para um estado de energia mais elevado. Este processo é normalmente muito mais fraco do que a absorção de um fóton (1PA) e a absorção de dois fótons (2PA), mas pode ser significativamente melhorado em certos materiais, como nanocristais semicondutores e corantes orgânicos.
O 3PA tem várias vantagens potenciais para bioimagem em relação ao 1PA e 2PA. Primeiro, o 3PA pode proporcionar uma penetração mais profunda no tecido porque a luz de comprimento de onda mais longo usada para o 3PA é menos espalhada e absorvida pelos componentes do tecido, como água e hemoglobina. Em segundo lugar, o 3PA pode ser usado para excitar a fluorescência em moléculas específicas com alta seletividade porque o comprimento de onda de excitação pode ser ajustado com precisão para corresponder ao espectro de absorção da molécula alvo. Terceiro, o 3PA pode gerar imagens de resolução mais alta porque o menor volume focal usado para microscopia 3PA resulta em menos fotodegradação e fotodano à amostra.
Apesar destas vantagens potenciais, o 3PA ainda não é amplamente utilizado para bioimagem devido a vários desafios. Primeiro, a eficiência do 3PA é normalmente muito baixa, exigindo altas potências de laser que podem danificar amostras biológicas. Em segundo lugar, o comprimento de onda de excitação do 3PA está frequentemente na faixa ultravioleta (UV), o que pode ser prejudicial às células. Terceiro, o desenvolvimento de sondas 3PA adequadas ainda está em seus estágios iniciais.
À medida que esses desafios forem superados, o 3PA provavelmente se tornará uma ferramenta mais importante para a bioimagem. Sua combinação única de penetração profunda nos tecidos, alta seletividade e alta resolução o torna ideal para uma variedade de aplicações, incluindo imagens in vivo, transferência de energia por ressonância de fluorescência (FRET) e microscopia de super-resolução.
Aqui estão alguns exemplos específicos de como o 3PA tem sido usado para bioimagem:
* A microscopia 3PA foi usada para obter imagens de vasos sanguíneos no cérebro de um camundongo vivo. O sinal 3PA foi gerado por um corante fluorescente que foi especificamente absorvido pelas células endoteliais, as células que revestem os vasos sanguíneos. Este estudo demonstrou o potencial do 3PA para imagens in vivo de estruturas de tecidos profundos.
* 3PA FRET tem sido usado para estudar interações proteicas em células vivas. Nesta técnica, dois corantes fluorescentes diferentes são ligados a duas proteínas diferentes de interesse. Quando as proteínas interagem, os corantes se aproximam e o sinal 3PA de um corante é transferido para o outro corante. Isso permite que os pesquisadores monitorem as interações proteicas em tempo real e com alta resolução espacial.
* A microscopia de super-resolução 3PA tem sido usada para criar imagens de estruturas em células com resolução inferior a 100 nanômetros. Esta técnica combina a alta resolução da microscopia 3PA com as capacidades de super-resolução de técnicas como microscopia de depleção de emissão estimulada (STED) e microscopia de localização fotoativada (PALM).
Estes exemplos demonstram o potencial do 3PA para bioimagem. À medida que os desafios associados ao 3PA são superados, esta técnica provavelmente se tornará cada vez mais importante para uma variedade de aplicações em pesquisa biomédica e diagnóstico clínico.
