Os pesquisadores desenvolveram uma nova técnica de imagem de DNA aprimorada que pode sondar a estrutura de fitas individuais de DNA em nanoescala. Uma vez que o DNA está na raiz de muitos processos de doenças, a técnica pode ajudar os cientistas a obter informações importantes sobre o que dá errado quando o DNA é danificado ou quando outros processos celulares afetam a expressão do gene.

O novo método de imagem baseia-se em uma técnica chamada microscopia de molécula única, adicionando informações sobre a orientação e o movimento dos corantes fluorescentes ligados à fita de DNA.

W. E. Moerner, Universidade de Stanford, EUA, é o fundador da espectroscopia de molécula única, um método inovador de 1989 que permitiu aos cientistas visualizar moléculas únicas com microscopia óptica pela primeira vez. Dos ganhadores do Prêmio Nobel de 2014 para microscopia óptica além do limite de difração (Moerner, Inferno e Betzig), Moerner e Betzig usaram moléculas únicas para criar imagens de uma matriz densa de moléculas em momentos diferentes.

No jornal da The Optical Society para pesquisas de alto impacto, Optica , a equipe de pesquisa liderada por Moerner descreve sua nova técnica e a demonstra através da obtenção de imagens de super-resolução e medições de orientação para milhares de moléculas de corante fluorescente individuais anexadas a fitas de DNA.

"Você pode pensar nessas novas medições como o fornecimento de pequenas setas de duas pontas que mostram a orientação das moléculas anexadas ao longo da fita de DNA, "disse Moerner." Esta informação de orientação informa sobre a estrutura local das bases do DNA porque elas restringem a molécula. Se não tivéssemos essas informações de orientação, a imagem seria apenas um ponto. "

Adicionando mais informações em nanoescala

Uma fita de DNA é muito longa, mas corda estreita, apenas alguns nanômetros de diâmetro. Microscopia de molécula única, junto com corantes fluorescentes que se ligam ao DNA, pode ser usado para visualizar melhor esta pequena corda. Até agora, era difícil entender como esses corantes eram orientados e impossível saber se o corante fluorescente estava ligado ao DNA de forma rígida ou um tanto solta.

Adam S. Backer, primeiro autor do artigo, desenvolveu uma maneira bastante simples de obter orientação e dinâmica rotacional de milhares de moléculas únicas em paralelo. "Nossa nova técnica de imagem examina como cada molécula de corante individual que rotula o DNA está alinhada em relação à estrutura muito maior do DNA, "disse Backer." Também estamos medindo o quão instável cada uma dessas moléculas é, que pode nos dizer se esta molécula está presa em um alinhamento particular ou se ela oscila ao longo de nossa sequência de medição. "

A nova técnica oferece informações mais detalhadas do que os métodos atuais de "conjunto", que calcula a média das orientações para um grupo de moléculas, e é muito mais rápido do que as técnicas de microscopia confocal, que analisam uma molécula de cada vez. O novo método pode ser usado até mesmo para moléculas que são relativamente escuras.

Como a técnica fornece informações em nanoescala sobre o próprio DNA, pode ser útil para monitorar alterações de conformação de DNA ou danos a uma determinada região do DNA, que apareceria como mudanças na orientação das moléculas de corante. Também pode ser usado para monitorar as interações entre DNA e proteínas, que conduzem muitos processos celulares.

30, 000 orientações de molécula única

Os pesquisadores testaram a técnica de imagem avançada de DNA usando-a para analisar um corante intercalante; um tipo de corante fluorescente que desliza nas áreas entre as bases do DNA. Em um experimento de imagem típico, eles adquirem até 300, 000 localizações de moléculas únicas e 30, 000 medições de orientação de molécula única em pouco mais de 13 minutos. A análise mostrou que as moléculas de corante individuais foram orientadas perpendicularmente ao eixo da fita de DNA e que, embora as moléculas tendessem a se orientar nesta direção perpendicular, eles também se moviam dentro de um cone restrito.

Em seguida, os pesquisadores realizaram uma análise semelhante usando um tipo diferente de corante fluorescente que consiste em duas partes:uma parte que se liga ao lado do DNA e uma parte fluorescente que é conectada por meio de uma corda flexível. A técnica de imagem aprimorada de DNA detectou essa fraqueza, mostrando que o método pode ser útil para ajudar os cientistas a entender, em uma base de molécula por molécula, se diferentes rótulos se ligam ao DNA de forma móvel ou fixa.

No papel, os pesquisadores demonstraram uma resolução espacial de cerca de 25 nanômetros e medições de orientação de molécula única com uma precisão de cerca de 5 graus. Eles também mediram a dinâmica rotacional, ou floppiness, de moléculas únicas com uma precisão de cerca de 20 graus.

Como funciona

Para adquirir informações de orientação de molécula única, os pesquisadores usaram uma técnica bem estudada que adiciona um elemento óptico chamado modulador eletro-óptico ao microscópio de molécula única. Para cada quadro de câmera, este dispositivo mudou a polarização da luz laser usada para iluminar todos os corantes fluorescentes.

Since fluorescent dye molecules with orientations most closely aligned with the laser light's polarization will appear brightest, measuring the brightness of each molecule in each camera frame allowed the researchers to quantify orientation and rotational dynamics on a molecule-by-molecule basis. Molecules that switched between bright and dark in sequential frames were rigidly constrained at a particular orientation while those that appeared bright for sequential frames were not rigidly holding their orientation.

"If someone has a single-molecule microscope, they can perform our technique pretty easily by adding the electro-optic modulator, " said Backer. "We've used fairly standard tools in a slightly different way and analyzed the data in a new way to gain additional biological and physical insight."