Uma técnica desenvolvida recentemente, conhecida como microscopia de fluorescência de folha de luz, levou a muitas descobertas biológicas, permitindo que os pesquisadores criassem imagens 3-D de tecido, até mesmo embriões de animais vivos, usando marcadores fluorescentes. Agora, pesquisadores relatam a capacidade de aumentar a profundidade de imagem da microscopia de fluorescência de folha de luz com o uso de um fenômeno óptico conhecido como absorção de três fótons.

No jornal The Optical Society (OSA) Cartas de Óptica , os pesquisadores relatam em detalhes como a absorção de três fótons pode ser usada com microscopia de fluorescência de folha de luz para obter imagens mais profundas dos tecidos. Como demonstração, eles usaram a técnica combinada para produzir imagens claras em uma bola de células cultivadas, conhecido como esferóide, cerca de 450 mícrons de diâmetro.

"Esta demonstração é muito importante, pois aborda uma necessidade não atendida de melhores imagens em profundidade, o que poderia ajudar os cientistas a obter melhores dados sobre os processos biológicos, "disse o líder da equipe de pesquisa, Kishan Dholakia, da University of St. Andrews no Reino Unido. "Esta abordagem pode ser especialmente útil para estudos de neurociência e biologia do desenvolvimento e pode ser aplicada na obtenção de imagens de várias amostras de maneira automatizada para a descoberta de medicamentos."

A luz necessária para criar imagens de rótulos fluorescentes pode ser prejudicial e até mesmo mortal para amostras biológicas delicadas, como tecido cerebral ou embriões de animais usados ​​para estudar o desenvolvimento e os processos de doenças. A microscopia de fluorescência de folha de luz permite rápido, imagem de alta resolução com pouco dano óptico porque ilumina uma amostra com apenas uma fina folha de luz; outras partes da amostra não recebem nenhuma exposição desnecessária à luz.

"Esperamos que a microscopia de fluorescência de folha de luz de três fótons tenha um grande impacto na imagem do cérebro em roedores, como camundongos e ratos, onde pode ser usado para capturar imagens de campo muito amplo com resolução subcelular, "disse o primeiro autor do jornal, Adrià Escobet-Montalbán.

Imagem mais profunda

Os pesquisadores queriam comparar a microscopia de fluorescência de folha de luz de três fótons com a absorção de dois fótons usada anteriormente. Na absorção multifotônica, o rótulo fluorescente emite luz após a absorção, ou sendo animado por, dois ou três fótons em vez de um fóton usado para produzir fluorescência tradicional.

A absorção multifotônica reduz a luz fora de foco e minimiza a luz que pode prejudicar a amostra porque usa comprimentos de onda mais longos, que estão menos espalhados pelo tecido, e confinando a luz de excitação a um pequeno volume. Quando três fótons são usados ​​para produzir fluorescência em vez de dois, esses benefícios são amplificados.

Para demonstrar sua nova técnica, os pesquisadores usaram uma configuração óptica padrão para microscopia de fluorescência de folha de luz com um laser pulsado que é tradicionalmente usado para excitação de dois fótons. Embora este laser não fosse o mais adequado para criar uma excitação eficiente de três fótons, era ideal para comparar a excitação de dois e três fótons.

A equipe de pesquisa criou imagens de esferóides de células renais embrionárias humanas usando excitação de dois e três fótons. Perto da superfície do esferóide, ambas as modalidades de imagem tiveram desempenho semelhante. Contudo, do outro lado do esferóide, a qualidade da imagem para a microscopia de fluorescência de folha de luz de três fótons preservou o contraste da imagem, enquanto a qualidade da imagem de dois fótons diminuiu consideravelmente.

Otimizando a técnica

Para melhorar ainda mais a imagem de profundidade e o campo de visão, os pesquisadores experimentaram mudar o perfil de intensidade de luz do laser para um feixe de Bessel, que tem um núcleo central brilhante rodeado por anéis concêntricos, em vez do tradicional feixe de laser Gaussiano sólido, como o de um apontador laser.

"Os feixes de Bessel podem ser usados ​​no modo de folha de luz de dois fótons, mas podem produzir artefatos potenciais devido aos seus anéis concêntricos, "disse o co-autor Federico Gasparoli." Pela primeira vez, mostramos numericamente e experimentalmente que esses problemas são suprimidos na microscopia de fluorescência de folha de luz de três fótons e que o feixe vai ainda mais fundo, tornando esta abordagem muito atraente. "

Próximo, os pesquisadores planejam melhorar a técnica usando sistemas de laser em comprimentos de onda mais longos que são projetados especificamente para a absorção de três fótons. Isso deve permitir a geração de imagens em maior profundidade. Em paralelo, os pesquisadores estão trabalhando para desenvolver maneiras de detectar a luz emitida por rótulos fluorescentes nas profundezas das amostras.