Pesquisadores da Universidade de Columbia deram um passo significativo para quebrar a chamada "barreira de cor" da microscopia de luz para sistemas biológicos, permitindo muito mais abrangente, rotulagem em todo o sistema e imagem de um maior número de biomoléculas em células e tecidos vivos do que é atualmente possível. O avanço tem potencial para muitas aplicações futuras, incluindo ajudar a orientar o desenvolvimento de terapias para tratar e curar doenças.

Em um estudo publicado online em 19 de abril em Natureza , O time, liderado pelo Professor Associado de Química Wei Min, relata o desenvolvimento de uma nova plataforma de microscopia óptica com sensibilidade de detecção drasticamente aprimorada. Adicionalmente, o estudo detalha a criação de novas moléculas que, quando emparelhado com a nova instrumentação, permitem a marcação e imagem simultâneas de até 24 biomoléculas específicas, quase cinco vezes o número de biomoléculas que podem ser visualizadas ao mesmo tempo com as tecnologias existentes.

"Na era da biologia de sistemas, como obter imagens simultaneamente de um grande número de espécies moleculares dentro de células com alta sensibilidade e especificidade continua sendo um grande desafio para a microscopia óptica, "Min disse." O que torna nosso trabalho novo e único é que há duas peças sinérgicas - instrumentação e moléculas - trabalhando juntas para combater esse obstáculo de longa data. Nossa plataforma tem a capacidade de transformar a compreensão de sistemas biológicos complexos:o vasto mapa de células humanas, vias metabólicas, as funções de várias estruturas dentro do cérebro, o ambiente interno de tumores, e montagem de macromolécula, para citar apenas alguns."

Todos os métodos existentes de observação de uma variedade de estruturas em células e tecidos vivos têm seus próprios pontos fortes, mas todos também são prejudicados por limitações fundamentais, não menos importante delas é a existência de uma "barreira de cor".

Microscópio Fluorescente, por exemplo, é extremamente sensível e, Como tal, é a técnica mais comum usada em laboratórios de biologia. O microscópio permite que os cientistas monitorem os processos celulares em sistemas vivos usando proteínas que são amplamente conhecidas como "proteínas fluorescentes" com geralmente até cinco cores. Cada uma das proteínas fluorescentes tem uma estrutura alvo que aplica uma etiqueta ", "ou cor para. As cinco proteínas fluorescentes, ou cores, normalmente usados ​​para marcar essas estruturas são BFP (Blue Fluorescent Protein), ECFP (Proteína Fluorescente Ciano), GFP (Proteína Fluorescente Verde), mVenus (proteína fluorescente amarela), e DsRed (Proteína Fluorescente Vermelha).

Apesar de seus pontos fortes, a microscopia de fluorescência é impedida pela "barreira de cor, "que limita os pesquisadores a ver um máximo de apenas cinco estruturas de cada vez porque as proteínas fluorescentes usadas emitem uma gama de tons indistinguíveis que, como resultado, caem em cinco categorias amplas de cores.

Se um pesquisador está tentando observar todas as centenas de estruturas e diferentes tipos de células em uma amostra de tecido tumoral cerebral vivo, por exemplo, ela estaria restrita a ver apenas até cinco estruturas por vez em uma única amostra de tecido. Se ela quisesse ver mais do que aqueles cinco, ela teria que limpar o tecido dos rótulos fluorescentes que usou para identificar e marcar as últimas cinco estruturas, a fim de usar esses mesmos rótulos fluorescentes para identificar outro conjunto de até cinco estruturas. Ela teria que repetir esse processo para cada conjunto de até cinco estruturas que deseja ver. Observar um máximo de cinco estruturas por vez não é apenas um trabalho intensivo, mas na limpeza do lenço, componentes vitais desse tecido podem ser perdidos ou danificados.

"Queremos vê-los todos ao mesmo tempo, para ver como estão operando por conta própria e também como estão interagindo uns com os outros, "disse Lu Wei, autor principal do estudo e pesquisador de pós-doutorado no Min lab. "Existem muitos componentes em um ambiente biológico e precisamos ser capazes de ver tudo simultaneamente para compreender verdadeiramente os processos."

Além da microscopia de fluorescência, atualmente, há uma variedade de técnicas de microscopia Raman em uso para observar células vivas e estruturas de tecidos que funcionam tornando visíveis as vibrações decorrentes de ligações químicas características nas estruturas. A microscopia Raman tradicional produz as cores altamente definidas que faltam na microscopia de fluorescência, mas está faltando a sensibilidade. Como tal, requer um forte, sinal vibracional concentrado que só pode ser alcançado pela presença de milhões de estruturas com a mesma ligação química. Se o sinal das ligações químicas não for forte o suficiente, visualizar a estrutura associada é quase impossível.

Para enfrentar este desafio, Min e sua equipe, incluindo os Profs. Virginia Cornish em química e Rafael Yuste em neurociência, buscou um novo híbrido de técnicas de microscopia existentes.

Eles desenvolveram uma nova plataforma chamada microscopia de espalhamento Raman estimulado por pré-ressonância eletrônica (epr-SRS) que combina o melhor dos dois mundos, reunindo um alto nível de sensibilidade e seletividade. A técnica inovadora identifica, com extrema especificidade, estruturas com concentração significativamente menor - em vez de milhões da mesma estrutura necessária para identificar a presença dessa estrutura na microscopia Raman tradicional, o novo instrumento requer apenas 30 para identificação. A técnica também utiliza um novo conjunto de moléculas de marcação projetadas pela equipe para trabalhar em sinergia com a tecnologia ultramoderna. A "paleta de cores" ampliada das moléculas amplia as capacidades de marcação, permitindo a imagem de até 24 estruturas por vez, em vez de ser limitado por apenas cinco cores fluorescentes. Os pesquisadores acreditam que há potencial para uma expansão ainda maior no futuro.

A equipe testou com sucesso a plataforma epr-SRS no tecido cerebral. "Pudemos ver as diferentes células trabalhando juntas, "Wei disse." Esse é o poder de uma paleta de cores maior. Agora podemos iluminar todas essas estruturas diferentes no tecido cerebral simultaneamente. No futuro, esperamos vê-los funcionar em tempo real. "O tecido cerebral não é a única coisa para a qual os pesquisadores imaginam que essa técnica será usada, ela adicionou. "Diferentes tipos de células têm diferentes funções, e os cientistas geralmente estudam apenas um tipo de célula por vez. Com mais cores, agora podemos começar a estudar várias células simultaneamente para observar como elas interagem e funcionam tanto sozinhas quanto juntas em condições saudáveis ​​versus em estados de doença. "

A nova plataforma tem muitas aplicações potenciais, Min disse, acrescentando que é possível que a técnica um dia seja usada no tratamento de tumores difíceis de matar com os medicamentos disponíveis. "Se pudermos ver como as estruturas estão interagindo nas células cancerosas, podemos identificar maneiras de direcionar estruturas específicas com mais precisão, "disse ele." Esta plataforma pode mudar o jogo na busca de entender qualquer coisa que tenha muitos componentes. "