Por Andy Pasquesi
Atualizado em 30 de agosto de 2022
As enzimas aceleram as reações químicas, diminuindo a energia de ativação necessária para a conversão do substrato. O número da rotatividade, k
cat , quantifica a eficiência catalítica de uma enzima medindo o número de moléculas de substrato convertidas em produto por sítio ativo da enzima por segundo sob condições de saturação do substrato.
1. Determinando velocidades de reação inicial
Etapa 1
Faça um gráfico da concentração do produto versus o tempo para o primeiro tubo de ensaio do seu ensaio enzimático. Use o tempo no eixo horizontal e a concentração do produto no eixo vertical.
Etapa 2
Calcule a inclinação da porção linear da curva (velocidade inicial, V
0 ). No Excel ou em uma calculadora gráfica, a linha de regressão linear fornecerá a inclinação diretamente. Se preferir uma estimativa manual, divida a alteração na concentração do produto entre dois pontos de dados consecutivos pela alteração correspondente no tempo.
Etapa 3
Registre esta inclinação como a velocidade de reação inicial, V
0 , para aquele tubo de ensaio. Na equação de regressão
09 , o coeficiente
19 é V
0 .
Etapa 4
Repita as etapas 1 a 3 para cada tubo de ensaio no ensaio para obter uma série de V
0 valores em diferentes concentrações de substrato.
2. Calculando Vmáx Usando o gráfico Lineweaver–Burk
Etapa 1
Crie um gráfico Lineweaver–Burk (recíproco duplo):gráfico
26 (concentração inversa de substrato) no eixo horizontal e
30 (velocidade inicial inversa) no eixo vertical. Por exemplo, se um tubo de ensaio tiver uma concentração inicial de substrato de 50 µM e um V
0 de 80 µMs
–1
, o ponto plotado seria (1/50 µM, 1/80 µMs
–1
).
Etapa 2
Execute uma regressão linear nesses pontos. A equação resultante assume a forma
49 , onde
57 é a interceptação y.
Etapa 3
Calcule o inverso de V
max tomando o inverso da interceptação y:
69 .
Etapa 4
Inverta o valor da etapa 3 para obter V
max :
71
Etapa 5
Identifique a concentração de enzima utilizada no ensaio (este valor é constante em todos os tubos de ensaio e deve ser relatado nos dados brutos).
Etapa 6
Calcular kcat dividindo Vmax pela concentração da enzima:
88
Isso produz o número de moléculas de substrato convertidas por sítio ativo da enzima por segundo.
Principais conclusões
Seguindo estas etapas sistemáticas - medir velocidades iniciais, construir um gráfico Lineweaver-Burk, extrair Vmax , e normalizando para a concentração da enzima – você pode determinar com precisão o número de renovação de uma enzima, kcat , uma métrica fundamental em enzimologia e desenvolvimento de medicamentos.
