p Dentro do fitotron, fileiras de armários industriais brancos escondem a vida esperada em uma estufa. Uma olhada através de uma porta de visualização quadrada, Contudo, revela a energia verde crescendo dentro da câmara brilhante. Essas mudas específicas de choupo podem não sobreviver às adversidades de secas prolongadas e ondas de calor, mas eles estão ajudando uma equipe de pesquisadores a fazer alguns que podem. p Estresse, como altas temperaturas e falta de água doce, pode causar redução no crescimento da colheita ou até mesmo perda total. A frequência crescente desses períodos estressantes inspira uma corrida para encontrar plantas mais tolerantes. Mas os métodos tradicionais de melhoramento de plantas são lentos, exigindo tentativa e erro em várias gerações. Agora, um grupo colaborativo de pesquisadores está redesenhando o álamo, uma safra de bioenergia, com base em seu genoma específico em apenas alguns anos.

p A crescente população humana está exigindo cada vez mais o uso de todos os tipos de terra. Para a indústria de biocombustíveis competir com as fontes convencionais de combustível, ela deve usar recursos terrestres, mas o ideal é não exigir as mesmas terras premium usadas para cultivar alimentos. Se as safras de biocombustíveis forem projetadas para serem mais tolerantes ao estresse, eles podem manter uma alta produção de biomassa em terras marginais - mantendo a indústria competitiva.

p Ano passado, o Escritório de Ciência do Departamento de Energia concedeu US $ 5,5 milhões para melhorar a produção de biomassa de choupo para a equipe multi-institucional da Universidade da Califórnia, Davis, Laboratório Nacional do Noroeste do Pacífico, e duas outras universidades:University of Tennessee (UT) e West Virginia University (WVU). O título do projeto é "SyPro Poplar:Improving Poplar Biomass Production under Abiotic Stress Conditions:An Integrated Omics, Bioinformática, Biologia sintética, e abordagem de engenharia genética. "

p Para o projeto de cinco anos, a equipe está "desenvolvendo alguns choupos por meio de uma abordagem transgênica que são tolerantes a vários estresses ao mesmo tempo, "diz o co-investigador principal Amir H. Ahkami. Ahkami é um biólogo molecular de planta com EMSL, o Laboratório de Ciências Moleculares Ambientais, uma facilidade de usuário do DOE Office of Science no PNNL.

p Combinações

p Estudos anteriores focaram apenas em um estresse abiótico - deficiência de água, temperatura elevada ou salinidade do solo - de cada vez, explica Ahkami. Na realidade, as plantas podem sofrer uma combinação de estresses simultaneamente. Então, encontrar uma solução específica para choupos nessas circunstâncias é o objetivo do projeto.

p O truque pode ser desenvolver uma série de promotores sintéticos - os promotores controlam a expressão do gene - que ativam os genes tolerantes ao estresse apropriados. Mas chegar lá exigirá uma combinação de abordagens avançadas e novas tecnologias.

p "Estamos reunindo biólogos celulares, biólogos moleculares, fisiologistas e um laboratório nacional em um esforço comum, "diz o biólogo vegetal Eduardo Blumwald, o principal investigador e um distinto professor de biologia celular na UC Davis. "Esta é uma abordagem multidisciplinar, e eu acho que este é o elemento mais importante. "

p Ahkami acrescenta, "E reunimos um grupo realmente bom de especialistas para este projeto."

p A transformação da planta requer uma sequência de DNA que combina um promotor e um gene. Começar com plantas que foram colocadas sob condições de estresse ajudará na identificação de importantes genes e proteínas responsivos ao estresse. Blumwald está aplicando testes de estresse controlado a plantas de choupo em uma estufa de pesquisa na UC Davis. Os tratamentos incluem a redução da disponibilidade de água, reduzindo a qualidade da água e desligando o resfriamento do efeito estufa.

p Em datas específicas ao longo dos tratamentos, Blumwald coleta amostras de folhas e raízes dos espécimes de choupo e as envia para o PNNL para análises de ômicas específicas de células e tecidos. Transcriptômica é o estudo do conjunto completo de transcritos de RNA produzidos pelo genoma de um organismo, enquanto a proteômica é o estudo de suas proteínas. A abordagem de ômicas específicas do tipo de célula é única e será informativa.

p Usando essa abordagem multiômica, Ahkami pode identificar os genes e proteínas altamente diferencialmente expressos em condições de estresse - que são expressos mais ou menos em comparação com aqueles em condições normais. Então, usando uma ferramenta de engenharia genética, como repetições palindrômicas curtas com espaçamento regular em cluster ou CRISPR, ele pode verificar a função de um gene de interesse.

p Ele pode então identificar promotores responsivos ao estresse com base nos genes e proteínas induzidos pelo estresse e, em colaboração com especialistas da UT, usar bioinformática para descobrir um elemento regulador específico, ou um motivo, que orienta a engenharia de um promotor.

p Teste de construção de projeto

p Ao projetar seus próprios promotores sintéticos, os pesquisadores não se restringem apenas aos promotores encontrados na natureza. Eles podem projetar aqueles que são específicos para a espécie e o tipo de célula, de modo que ativem os genes certos apenas quando necessário.

p “Queremos interferir o mínimo possível no desenvolvimento da árvore, "diz Blumwald." Se vamos expressar um gene constitutivamente o tempo todo, corremos o risco de que o gene torne as plantas um pouco menores, por exemplo."

p Ele compara isso a uma pessoa indo ao supermercado. Se alguém for comprar comida no caminho para o trabalho, então ele ou ela deve lidar com a comida no carro ou no ônibus e no trabalho - é complicado, ele diz. Fazendo compras depois do trabalho, essa pessoa obtém comida apenas quando ela é necessária. Os traços resistentes ao estresse só devem ser expressos quando desejados.

p Usando o conhecimento adquirido com omics e bibliotecas de promotores existentes, os pesquisadores irão projetar, construir e testar um conjunto de potenciais promotores sintéticos. Mais de cem promotores serão selecionados com protoplastos derivados de folhas e raízes de choupo - células com paredes celulares removidas - usando um sistema robótico no co-investigador principal C. Neal Stewart, Laboratório de Jr. na UT. Para saber se um promotor está trabalhando, os pesquisadores vão procurar uma proteína fluorescente para acender, explica Stewart, um professor de ciências vegetais, que se concentra em genética de plantas.

p "É uma das coisas em que você obtém muitas falhas, mas tudo que você precisa é de um ou dois hits, "diz Stewart, "E então é um sucesso."

p A equipe instalará os melhores promotores artificiais em plantas de álamo para conduzir o gene de interesse. Então, os pesquisadores avaliarão as plantas transgênicas na estufa de pesquisa.

p O projeto termina com um estudo de campo, o que o diferencia da maioria dos outros projetos. “Quase sempre acontece que o desempenho em condições de campo é diferente do desempenho em estufa, "diz o co-investigador principal Stephen DiFazio, um professor de genômica de plantas que supervisionará os testes de campo na WVU.

p O campo expõe as plantas transgênicas a outros estresses, como o vento, geada, insetos, e patógenos, não visto no ambiente de estufa. Os testes de campo podem revelar se a alteração da expressão de um gene nativo interrompeu outro sistema da planta, explica DiFazio.

p Progresso até agora

p O estudo de campo ainda está a alguns anos de distância, porque o projeto agora está chegando ao fim do primeiro ano. O projeto é desafiador, diz Ahkami, mas ele está otimista.

p "Os dados que geramos até agora, particularmente para proteômica, são muito promissores, ", diz ele." Os identificadores de proteínas que encontramos em cada tipo de célula fornecem uma prova de conceito para uma técnica que poderia ser amplamente usada para fenotipagem molecular de folhas de choupo e tecidos de raiz sob estresse em resolução em nível de célula. "

p Ahkami e o resto da equipe da EMSL não estariam neste estágio sem a capacidade de integrar vários recursos disponíveis nas instalações do usuário - alguns dos quais nunca foram combinados antes. Recentemente, EMSL anunciou uma reorganização e realinhamento para novas áreas de ciências, e sua área de Ciências Biológicas visa, entre outros focos, para melhorar as estratégias de projeto de plantas para a produção de biocombustíveis, que é o objetivo do projeto SyPro Poplar.

p Certas ferramentas essenciais e experiência em EMSL permitem a nova análise específica de tipo de célula do projeto. A partir das amostras de folhas e raízes, os pesquisadores podem direcionar tipos de células específicos para colheita usando microdissecção de captura a laser ou LCM. Por exemplo, uma folha tem células mesófilas esponjosas e paliçadas e tecidos vasculares, e uma raiz possui células da epiderme e do córtex e tecidos estelares. A alta resolução do microscópio LCM da EMSL permite que os pesquisadores selecionem manualmente as células de um determinado tipo. O sistema cortará as células desejadas e as catapultará sem contato para um dispositivo de coleta.

p Ao isolar a célula ou tecido por tipo, "você está enriquecendo o seu sinal, isolar uma população muito mais específica sobre a qual você pode fazer seus aplicativos downstream e perguntas, "diz Will Chrisler, Especialista em LCM da PNNL. Usar uma amostra de folha ou raiz em massa pode facilmente ocultar o sinal.

p Antes da análise proteômica por espectrometria de massa, a equipe de pesquisa precisa preparar as amostras específicas do tipo de célula coletadas pelo LCM. A tecnologia desenvolvida recentemente, chamada nanoPOTS (processamento de nanodroplet em um pote para amostras de rastreamento), desempenha um papel fundamental aqui.

p "O gargalo com a proteômica era com o processamento da amostra, "diz o químico analítico Ryan Kelly, um dos desenvolvedores nanoPOTS, que mantém um compromisso conjunto com EMSL, enquanto agora na Universidade Brigham Young. Requeria muitas células, porque a maior parte da amostra foi perdida ao passar da matéria-prima para a pronta para análise. As proteínas não podem ser amplificadas como o DNA e o RNA.

p Mas agora o nanoPOTS permite que a equipe meça proteínas em amostras que são 100 a 1000 vezes menores do que as usadas anteriormente, explica Kelly.

p O poder dessas ferramentas é parte do que permite que um projeto de tal magnitude avance com tanta rapidez em apenas cinco anos.

p Choupo popular

p Outro fator que agiliza o trabalho é o assunto:o choupo. Uma característica conveniente é sua facilidade na propagação vegetativa, de acordo com DiFazio. Estacas de caule colocadas no solo enraizarão facilmente. A maioria das árvores leva cinco anos para florescer, então, esperar pelas sementes levaria a duração do projeto, ele explica. Em vez de, a propagação vegetativa permite que os pesquisadores façam centenas ou mesmo milhares de cópias exatas do original em alguns meses. Mais, as cópias mantêm as melhorias genéticas, ao contrário das sementes que podem perdê-las ao cruzar com outra planta-mãe.

p Essa propriedade, junto com sua facilidade de gerenciamento em estufas e ambientes de pesquisa, faz do choupo uma planta bem estudada. As informações sobre o choupo são abundantes, incluindo toda a sequência do genoma. Também possui um sistema de transformação eficiente, ao contrário da maioria das outras árvores.

p O álamo já é amplamente distribuído nos Estados Unidos e no Canadá. Mas se a equipe for bem-sucedida, diz Ahkami, então os produtores podem expandir o choupo para mais áreas e condições onde atualmente não prosperam, disponibilizando mais biomassa.

p DiFazio pensa em regiões rurais, como as comunidades de carvão em seu estado natal, Virgínia Ocidental, que estão perdendo suas fontes de renda tradicionais. “Essas comunidades teriam a oportunidade de ter um grande papel na economia de energia, se pudermos desenvolver plantações que crescerão nas terras marginais que são abundantes nessas partes do país, " ele diz.

p Um desses locais são as minas de superfície. “Completa o ciclo, " ele diz.

p Logo em terras industriais, fileiras após fileiras de energia verde poderiam estar aparecendo.