A cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) é uma técnica de laboratório usada para separar e identificar compostos. É um tipo de cromatografia em coluna que se baseia em diferentes polaridades dos compostos em uma solução para separá-los. A HPLC difere da cromatografia em coluna padrão porque usa pressão para forçar a solução através da coluna mais rapidamente e, portanto, produz resultados mais rápidos e, às vezes, mais precisos. O objetivo é separar compostos na coluna e fazê-los sair separadamente.
Coelution

Devido à velocidade do HPLC e à dependência de diferentes polaridades dos compostos, dois compostos com estrutura e polaridades semelhantes podem sair do aparelho de cromatografia ao mesmo tempo ou quase ao mesmo tempo. Isso é conhecido como coeluição. A coeluição dificulta a determinação exata de qual porção da mistura eluiu em que ponto.
Compostos adsorvidos
HPLC normalmente usa uma coluna de vidro cheia de contas feitas de diferentes materiais. As misturas forçadas através da coluna têm produtos químicos que se ligam com diferentes forças às esferas. A força da ligação, que depende da similaridade na polaridade, determina quanto tempo o produto químico se ligará ao cordão antes de ser liberado. Alguns compostos se ligam com tanta força que, essencialmente, nunca são liberados das contas da coluna e nunca são medidos na solução que sai da coluna.
Custo

As técnicas típicas de separação em laboratório envolvem o desenvolvimento de um ensaio ou método de separação e, em seguida, implementando esse ensaio para separar compostos individuais de uma solução. No entanto, isso geralmente resulta em várias soluções que também precisam ser submetidas a procedimentos, levando a um aumento exponencial da complexidade. Embora a HPLC possa frequentemente simplificar e acelerar esse processo, o custo do desenvolvimento de um aparelho de HPLC pode se tornar tremendo. O desenvolvimento de um aparelho de HPLC, embora muito mais eficiente, é muito mais caro do que o desenvolvimento de outros ensaios para a separação de compostos. Isso torna inviável financeiramente para muitos pequenos laboratórios particulares.
Complexidade

A HPLC não é usada apenas para separar compostos simples, mas também para isolar proteínas específicas de uma mistura celular. Nesse caso, as contas da coluna geralmente são revestidas com um anticorpo específico para a proteína que você precisa coletar. As proteínas ligam os anticorpos e a solução restante é passada através da coluna; em seguida, as proteínas são liberadas usando outra solução e coletadas. Isso requer um técnico altamente qualificado para monitorar a coluna o tempo todo e garantir que o processo esteja executando exatamente como planejado.