Figura 1. Uma abordagem integrada de HS-AFM e ancoragem molecular para revelar o mecanismo de ligação de Apt-7 a CYP24 (A) A visão tridimensional das conformações ancoradas de alto nível de CYP24 e Apt-7. Os locais de ligação previstos de Apt-7 são mostrados por seta. O aptâmero liga-se ao sítio de ligação do substrato do CYP24 (sítio de ligação-1) e ao sítio de ligação do ADX do CYP24 (sítio de ligação-2). (B) Comparação dos gráficos pseudo-HS-AFM de CYP24-Apt-7 usando a pose de primeira classificação gerada por encaixe molecular do complexo CYP24-Apt-7 com as imagens em tempo real capturadas por HS-AFM. Crédito:Universidade de Kanazawa
Pesquisadores da Universidade de Kanazawa em colaboração com equipes da Toyama Prefectural University e BioSeeds Corporation relatam em
ACS Applied Materials &Interfaces a identificação de uma molécula com atividade antiproliferativa aumentada em células cancerosas. O mecanismo biomolecular subjacente é a inibição de uma enzima que é superproduzida em vários tipos de câncer.
A vitamina D3 tem funções biológicas importantes, incluindo a manutenção da densidade mineral óssea, o que minimiza o risco de fratura óssea. Mas acredita-se que a vitamina D3 também tenha atividade anticancerígena, pois os baixos níveis de vitamina D3 e a superprodução associada de uma enzima chamada CYP24 estão ligados a um prognóstico ruim para pacientes com câncer. Moléculas que limitam ou inibem a ação do CYP24 e moléculas que mimetizam a função da vitamina D3 são atualmente muito pesquisadas como potenciais agentes antiproliferativos para o tratamento do câncer.
No entanto, muitos dos inibidores e análogos de D3 sintetizados até agora mostraram resposta clínica insuficiente, bem como efeitos colaterais indesejados. Agora, Madhu Biyani da Universidade de Kanazawa e colegas identificaram uma molécula derivada de DNA que se liga e inibe a função do CYP24 e mostra atividade antiproliferativa promissora. A equipe de pesquisa também fornece informações detalhadas sobre os processos moleculares relevantes em jogo.
Os cientistas examinaram um grande número de aptâmeros de DNA – pedaços de DNA de fita simples com estruturas tridimensionais particulares que podem se ligar a moléculas-alvo específicas e ter um efeito funcional na ligação. Eles procuraram aptâmeros de DNA que se ligam ao CYP24, mas não à enzima semelhante CYP271B, que é responsável pela síntese da vitamina D3.
Uma longa lista inicial de 18 candidatos a aptâmeros foi reduzida para 11 representantes com estruturas moleculares específicas. Os pesquisadores verificaram a atividade de inibição do CYP24 dos 11 aptâmeros representativos in vitro. Restaram quatro candidatos resultando na inibição do CYP24, mas não na inibição do CYP27B1, dos quais um (Apt-7) foi retido para estudo adicional.
Figura 2. A internalização do aptâmero em células A549 é indispensável para a inibição do CYP24 e para o aumento da inibição do crescimento celular mediada por 1, 25-D3. (A) Internalização do Aptâmero em células A549. Células de câncer de pulmão A549 foram tratadas com 500 nM de aptâmero Apt-7 e tiveram suas membranas coradas de verde (Conjugados de Aglutinina de Gérmen de Trigo (WGA)). A microscopia confocal revelou o sinal intracelular, derivado do aptâmero internalizado (fluorescência vermelha, Cy3). (B) Apt-7 inibe o catabolismo mediado por CYP24 de 1,25-D3 em células A549. Após 18 h de tratamento com aptâmero, a taxa de conversão do metabólito 1, 25-D3 e a atividade relativa do CYP24 foram determinadas por HPLC. (C) Apt-7 aumenta a função antiproliferativa de 1,25-D3 em células A549. Crédito:Universidade de Kanazawa
Biyani e colegas realizaram simulações da ligação do Apt-7 ao CYP24. Um cenário de encaixe molecular foi obtido, que eles verificaram experimentalmente comparando o comportamento de uma mistura de vitamina D3 e CYP24 com e sem Apt-7. As simulações e os experimentos mostraram que o Apt-7 resulta na inibição da atividade do CYP24, e que o que acontece é que o aptâmero provavelmente interfere no sítio ativo da enzima. Os pesquisadores também realizaram microscopia de força atômica de alta velocidade na ligação de CYP24 e Apt-7 em tempo real, confirmando o cenário de docagem molecular obtido a partir de simulações.
Finalmente, a equipe de pesquisa estudou o efeito do Apt-7 no nível celular, introduzindo a molécula nas células cancerígenas. Eles observaram inibição significativa do CYP24 para uma linhagem de células cancerígenas conhecidas por superexpressar a enzima CYP24, mostrando assim atividade antiproliferativa. Citando Biyani e colegas, essas descobertas “claramente caracterizaram e propuseram que uma molécula baseada em aptâmeros de DNA poderia ser um candidato promissor para terapia anticâncer”.
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